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標(biāo)題：The landscape of lncRNAs in Cydia pomonella provides insights into their signatures and potential roles in transcriptional regulation

標(biāo)題：蘋(píng)果小卷蛾中l(wèi)ncRNA的特征及l(fā)ncRNA在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過(guò)程中的作用

雜志：BMC Genomics

通訊作者：Wei Fan,1  Fanghao Wan,1,2  Wanqiang 1

機(jī)構(gòu)：1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 深圳農(nóng)業(yè)基因組學(xué)研究所 深圳分院，廣東省嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部基因組分析實(shí)驗(yàn)室，深圳 ，2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京

文章鏈接：doi: 10.1186/s12864-020-07313-3

發(fā)布時(shí)間：Published online 2021 Jan 5

摘要：蘋(píng)果小卷蛾（Cydia pomonella L.）是我國(guó)重要的入侵物種；然而，lncRNAs在這種昆蟲(chóng)中的功能影響尚不清楚。在這項(xiàng)研究中，基于公開(kāi)的RNA-seq數(shù)據(jù)集，構(gòu)建了一份蛾類(lèi)的lncRNAs圖譜。

共鑒定出9161個(gè)位點(diǎn)編碼的9875個(gè)lncRNA轉(zhuǎn)錄本。

正如預(yù)期的那樣，lncRNAs顯示出比蛋白編碼基因(PCGs)更短的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度，更低的GC含量和更低的表達(dá)水平。此外，與PCG相比，lncRNA更有可能表現(xiàn)出組織特異性的表達(dá)模式。此外，保守性分析表明，lncRNA序列在昆蟲(chóng)間的保守性很弱，但基于共線性可以識(shí)別出更多同源的lncRNAs，這表明共線性可能是一種更可靠的跨物種比較lncRNAs的方法。此外，lncRNAs與相鄰PCG的相關(guān)性分析表明，它們之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，表明這些lncRNAs在基因表達(dá)調(diào)控中具有潛在的順式作用。

該研究為lncRNAs的比較和功能研究提供了有價(jià)值的資源，這將有助于理解它們?cè)谵D(zhuǎn)錄調(diào)控中的機(jī)制作用。

關(guān)鍵詞：長(zhǎng)非編碼RNA，保守性，共線性，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，蘋(píng)果小卷蛾

材料方法：

數(shù)據(jù)：14個(gè)樣本（雌頭、雄頭、雌性中腸、雄性中腸、睪丸、卵巢、附腺) 各兩個(gè)生物重復(fù)的樣本；SRP083782(SRR4101328-SRR4101341)

2個(gè)沒(méi)有生物學(xué)重復(fù)的樣本（雄性和雌性觸角）SRP060413 (SRX1082030, SRX1082029)

5個(gè)不同發(fā)育期的樣本（2個(gè)胚胎期，幼蟲(chóng)期、蛹期、成蟲(chóng)期各1個(gè)）SRP181710 (SRR8479435, SRR8479438,SRR8479439, SRR8479440, SRR8479441)

1.轉(zhuǎn)錄本組裝：

• 質(zhì)控：FastQC：
• 過(guò)濾：Trimmomatic v1.3
• 比對(duì)：GSNAP version 2019-06-10
• 組裝：StringTie v1.3.3b
• 轉(zhuǎn)錄本分類(lèi)：gffcompare v0.10.1

2.lncRNA鑒定：

• 轉(zhuǎn)錄本類(lèi)型：u i x
• 長(zhǎng)度大于200nt
• 至少有兩個(gè)外顯子
• CPC CNCI 不具備編碼能力
• ORF小于300nt
• BLASTX比對(duì)到SwissProt ，無(wú)顯著匹配 E-value = 1e-3
• Pfam無(wú)顯著匹配（E-value = 1e-3）
• RPKM >1

3.組織特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本分析

為了衡量每個(gè)基因的組織特異性水平，我們計(jì)算了JS散度分?jǐn)?shù)，作為跨九個(gè)不同組織或五個(gè)發(fā)育階段的特異性指數(shù)。對(duì)于每組，我們計(jì)算所有重復(fù)的平均值，并計(jì)算JS得分。一般來(lái)說(shuō)，JS評(píng)分范圍在0到1之間，值越大，表明基因的特異性越高。

為了避免受到表達(dá)量水平的干擾，編碼基因和LncRNA根據(jù)每個(gè)基因在9個(gè)樣本中的最大RPKM值被分為三組(低：RPKMmax<5.0；中等：5.0≤RPKMmax<50.0；PRKMmax≥5 0.0)，并分別計(jì)算3組的JS評(píng)分。先前的一項(xiàng)基準(zhǔn)研究表明，tau指數(shù)是衡量基因表達(dá)的組織特異性的良好指標(biāo)。

4.轉(zhuǎn)錄本豐度評(píng)估與差異表達(dá)分析

To estimate the expression levels of PCGs and lncRNAs, HTSeq v0.10.0

• 差異分析DESeq2  p-value < 0.05 and a |log2fold-change| ≥ 1.0

5.序列保守性分析

與7個(gè)具有代表性的昆蟲(chóng)進(jìn)行比對(duì)。A. aegypti  A. gambiae   B. mori   N. lugens    P. xylostella  A. mellifera  D. melanogaster

6.lncRNA同源性分析

Python pipeline https://github.com/Gabaldonlab/Synthenic-Families

比較了家蠶和蛾之間的lncRNA。

7.LncRNAs與鄰近PCG的相關(guān)性分析

使用lncRNA上下游10kb的編碼基因的RPKM計(jì)算PCC。

8.富集分析

GO  q-values < 0.05

結(jié)果

1.在蘋(píng)果小卷蛾中鑒定到9875個(gè)lncRNA

9875 個(gè)lncRNAs 9161 個(gè)位點(diǎn)。下圖A為鑒定 到的 lncRNA類(lèi)型。B是其他昆蟲(chóng)中l(wèi)ncRNA的鑒定情況，做了下比較。

在大多數(shù)物種中，基因間區(qū)的lncRNA占大多數(shù)。

2.lncRNA的特征描述

• lncRNA轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度小于mRNA
• lncRNA主要含有2個(gè)外顯子
• lncRNA GC含量低于mRNA
• lncNATs的表達(dá)水平略高于mRNAs。
• 共有11782個(gè)PCG與先前預(yù)測(cè)的TES重疊，占所有PCG的53.16%。相比之下，與TE重疊的lncRNAs比例明顯更高(9875個(gè)中的7786個(gè)，78.85%)
• 對(duì)于lncRNA，大部分重疊的TES被歸類(lèi)為未知。Lines、RC/Helitrons和DNA轉(zhuǎn)座子是lncRNA前三個(gè)TES。另一方面，SINES和LTRS很少與lncRNAs相關(guān)

3.lncRNA在不同發(fā)育期和不同組織的表達(dá)模式

睪丸、雌性觸角和附腺是表達(dá)最特異的lncRNAs的前三個(gè)組織。附腺和睪丸是特異性分?jǐn)?shù)最高的組織。相比之下，卵巢的特異性得分最低?？偟膩?lái)說(shuō)，，lncRNAs表現(xiàn)出比mRNAs更顯著的時(shí)空特異性表達(dá)模式。

4.lncRNA的差異表達(dá)和性別偏向表達(dá)模式

lncRNA更加偏好雄性表達(dá)。這個(gè)差異分析比較容易復(fù)現(xiàn)，基本上看我六年前的表達(dá)芯片的公共數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘系列推文即可；

• 解讀GEO數(shù)據(jù)存放規(guī)律及下載，一文就夠
• 解讀SRA數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)律一文就夠
• 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載得到表達(dá)矩陣 一文就夠
• GSEA分析一文就夠（單機(jī)版+R語(yǔ)言版）
• 根據(jù)分組信息做差異分析- 這個(gè)一文不夠的
• 差異分析得到的結(jié)果注釋一文就夠

5.lncRNA的同源關(guān)系基于共線性而不是序列保守性

LncRNAs在昆蟲(chóng)物種間表現(xiàn)出很弱的序列保守性，特別是對(duì)于進(jìn)化距離較遠(yuǎn)的昆蟲(chóng)。

6.lncRNA與鄰近編碼基因更高的相關(guān)性

大量lncRNA的功能是未知的，但是它們主要是cis-regulators，所以可以根據(jù)它們臨近的蛋白編碼基因功能來(lái)近似推斷，然后表達(dá)量的相關(guān)性也可以類(lèi)推到。

• 根據(jù)位置關(guān)系推斷 使用bedtools等工具！

• 表達(dá)量的相關(guān)性， 比如雜志Cancer Medicine, 2020的文章《 Genome-wide DNA methylation analysis by MethylRad and the transcriptome profiles reveal the potential cancer-related lncRNAs in colon cancer》，在進(jìn)行結(jié)直腸癌相關(guān)lncRNA的功能富集分析，就是采用LncRN2Target v2.0和StarBase分析與15個(gè)lncRNA共表達(dá)的蛋白編碼基因，其中l(wèi)ncRNA HULC和ZNF667-AS1分別鑒定到28個(gè)、9個(gè)共表達(dá)的蛋白編碼基因！

大多數(shù)(6831，69.17%)的lncRNA具有相鄰的編碼基因。共有3199對(duì)LncRNA編碼基因(GP)的PCC絕對(duì)值>0.5，這些LncRNA代表了潛在的具有順式調(diào)控功能的候選基因。

大比例的lncRNAs與鄰近的PCG顯示出更強(qiáng)的相關(guān)性，并可能在基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮順式作用。