lncRNA的生物學(xué)功能【1】
目前人們對(duì)lncRNA認(rèn)識(shí)還處在初級(jí)階段，lncRNA起初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能。然而大量研究表明，lncRNA在細(xì)胞核內(nèi)、核外，通過(guò)染色質(zhì)修飾，轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種方式調(diào)節(jié)基因表達(dá)，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。
lncRNA在腫瘤中的作用機(jī)制【2】
腫瘤中部分已知lncRNA【3】
lncRNA功能研究的基本思路
一般來(lái)說(shuō)，lncRNA功能研究的主線包含3個(gè)主要步驟：
（1）高通量篩選。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和lncRNA芯片是目前最常用的技術(shù)手段，通過(guò)這種高通量的篩選方法，可以快速獲得不同實(shí)驗(yàn)組間差異表達(dá)的lncRNA和mRNA。
（2）候選lncRNA的確定。通過(guò)生物信息學(xué)分析，從大量lncRNA 中篩選有潛在功能意義的lncRNA。
（3）目標(biāo)lncRNA的功能分析與驗(yàn)證。根據(jù)上述生物信息分析推斷出lncRNA可能的生物學(xué)功能，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證假設(shè)是否成立。
lncRNA研究的基本流程
生物信息學(xué)——確定候選lncRNA
1
lncRNA和mRNA的差異表達(dá)分析
通常所說(shuō)的lncRNA測(cè)序其實(shí)就是全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與普通mRNA測(cè)序不同的是，lncRNA測(cè)序是通過(guò)rRNA去除從而對(duì)含有polyA結(jié)構(gòu)和不含polyA的RNA一同富集并建庫(kù)測(cè)序。理論上這種策略能夠鑒定到更多的lncRNA，并且能夠與mRNA同時(shí)進(jìn)行分析，更有利于推測(cè)lncRNA可能的調(diào)控途徑。同樣的，lncRNA芯片也同時(shí)包含mRNA和lncRNA的探針，以上這些優(yōu)勢(shì)使得lncRNA測(cè)序和芯片技術(shù)成為了目前最主流的高通量篩選手段。
lncRNA歷年文獻(xiàn)發(fā)表情況【3】
2
確定候選的lncRNA
因?yàn)槟壳耙阎膌ncRNA數(shù)量非常龐大，加上轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定出來(lái)的新lncRNA，一次實(shí)驗(yàn)往往能夠獲得非常大量的差異表達(dá)lncRNA，因此除了通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)的篩選（比如fold-change和p-value），必須利用各種生物信息學(xué)方法進(jìn)一步推測(cè)這些差異表達(dá)lncRNA的功能，確定與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的lncRNA做為候選。主要的方法有以下一些：
（1）根據(jù)lncRNA在基因組上的位置進(jìn)行篩選
根據(jù)lncRNA在基因組上與附近mRNA的位置關(guān)系， lncRNA可以分為以下五種類(lèi)型：
lncRNA的類(lèi)別示意圖【4】
（2）根據(jù)lncRNA的靶基因進(jìn)行篩選
雖然目前數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄了數(shù)量龐大的lncRNA序列，但絕大部分僅僅是序列而已，但是基因組中的3萬(wàn)多個(gè)基因的功能卻是相對(duì)比較清楚的，因此我們可以首先通過(guò)預(yù)測(cè)lncRNA與mRNA之間可能的靶向調(diào)控關(guān)系，進(jìn)而根據(jù)mRNA的功能反過(guò)來(lái)推測(cè)lncRNA的功能。
cis靶基因：lncRNA的順式作用靶基因主要是基于其對(duì)于基因組位置上下游基因的影響來(lái)進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用已有的基因組注釋文件，對(duì)lncRNA上下游10kb區(qū)域內(nèi)進(jìn)行尋找，所有關(guān)聯(lián)到的基因均可作為lncRNA的cis靶基因。
trans靶基因：lncRNA的反式作用靶基因主要是基于序列互補(bǔ)進(jìn)行的。其認(rèn)為lncRNA序列和對(duì)應(yīng)的靶基因序列互補(bǔ)，可以將其他因子攜帶到靶基因上進(jìn)行調(diào)控。使用軟件為blast和RNAplex，blast進(jìn)行序列互補(bǔ)計(jì)算，RNAplex進(jìn)行熱力學(xué)上的互補(bǔ)計(jì)算。
靶基因富集分析：獲得靶基因之后，我們也可以進(jìn)一步通過(guò)靶基因的功能和參與的pathway進(jìn)行富集分析，通過(guò)顯著性富集的GO或pathway與疾病之間的關(guān)系，再反過(guò)來(lái)尋找對(duì)應(yīng)的lncRNA。
lncRNA靶基因的pathway富集
（3）根據(jù)lncRNA與mRNA在表達(dá)上的協(xié)同關(guān)系進(jìn)行推斷
共表達(dá)分析（co-expression）
基因表達(dá)受到復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，這包括其他基因和非編碼RNA，通過(guò)共表達(dá)計(jì)算構(gòu)建共表達(dá)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)篩選具有hub地位的lncRNA（即該lncRNA與其它基因具有很高的連通度）。
lncRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)示例圖
也可以分別構(gòu)建疾病組和對(duì)照組的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，然后比較兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)之間“地位”變化最明顯的lncRNA。另一方面，在已知某個(gè)mRNA功能的前提下，也可以直接通過(guò)這種方法，直接尋找到與該mRNA關(guān)系最密切的lncRNA。
疾病組網(wǎng)絡(luò) 對(duì)照組網(wǎng)絡(luò)【5】
加權(quán)共表達(dá)分析（WGCNA）
加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(weighted gene co-expression network analysis)算法作為一種高效、準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)挖掘方法，日前應(yīng)用非常廣泛【6】。
WGCNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析示例圖
WGCNA算法致力于尋找協(xié)同表達(dá)的基因模塊(module)，并探索基因網(wǎng)絡(luò)與研究者關(guān)注的表型之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。module被定義為一組具有類(lèi)似表達(dá)譜的基因，如果某些基因在一個(gè)生理過(guò)程或不同組織中總是具有相類(lèi)似的表達(dá)變化，那么我們有理由認(rèn)為這些基因在功能上是相關(guān)的，可以把他們定義為一個(gè)模塊。也可以這么理解，每個(gè)模塊就是一個(gè)“超級(jí)基因”，它的表達(dá)量是所有成員共同作用的結(jié)果。以上所說(shuō)的“基因”時(shí)候一個(gè)廣義的概念，當(dāng)我們把mRNA和lncRNA放在一起進(jìn)行分析時(shí)，module中就同時(shí)包含了兩者的信息。由于目前已知功能的lncRNA微乎其微，這種分析策略非常有助于尋找跟我們所熟知的mRNA關(guān)系密切的那些lncRNA，從而有效縮小候選lncRNA的范圍。
4）基于lncRNA與protein的關(guān)系進(jìn)行篩選
通過(guò)以上生物信息學(xué)手段，能夠推斷出lncRNA與mRNA可能存在的調(diào)控關(guān)系，但這僅僅是計(jì)算的層面，在生物學(xué)層面上這種調(diào)控往往是通過(guò)lncRNA-蛋白復(fù)合物的形式發(fā)揮作用的。即lncRNA首先與某些蛋白（包括轉(zhuǎn)錄因子、表觀修飾因子等）形成RNA-protein復(fù)合體，然后再與下游的DNA結(jié)合，調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄。
lncRNA介導(dǎo)的這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用多為trans調(diào)控，即lncRNA對(duì)其他染色體上編碼基因的調(diào)控。
linc1992-hnRNPL復(fù)合體對(duì)TNFα的調(diào)控【8】
但也有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-protein 也能夠以cis的方式對(duì)同一染色體上臨近mRNA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。
lncTCF7-SWI/SNF復(fù)合體激活附近的TCF7表達(dá)【9】
通過(guò)類(lèi)似這種模式，lncRNA也可以作為分子阻斷劑。這一類(lèi)lncRNA被轉(zhuǎn)錄后，會(huì)直接和蛋白結(jié)合，由于lncRNA的結(jié)合，這類(lèi)蛋白的功能被阻斷，從而影響了下游的基因轉(zhuǎn)錄?；蛘?，lncRNA跟蛋白的結(jié)合，妨礙了該蛋白與另一個(gè)蛋白形成復(fù)合物，即可抑制了蛋白之間形成有功能的復(fù)合體。
（5）根據(jù)lncRNA與miRNA的靶向關(guān)系篩選
細(xì)胞內(nèi)存在競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（Competitive endogenous RNA，ceRNA），這些ceRNA分子（mRNA，lncRNA、假基因等）能夠通過(guò)miRNA應(yīng)答元件（MicroRNA Response Element，MRE）競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合相同的miRNA以達(dá)到調(diào)節(jié)彼此表達(dá)水平。細(xì)胞內(nèi)除mRNA之外，還存在另外一些RNA分子，比如長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）也存在miRNA應(yīng)答元件（MRE），當(dāng)lncRNA與mRNA存在相同的MRE時(shí)，他們之間構(gòu)成了競(jìng)爭(zhēng)相同種類(lèi)miRNA的關(guān)系，換句話說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)lncRNA表達(dá)水平的高低，直接影響了可被相應(yīng)mRNA結(jié)合的miRNA數(shù)量的多少，也就是說(shuō)，lncRNA通過(guò)MRE這個(gè)橋梁，間接地調(diào)控了mRNA的表達(dá)水平，從而調(diào)控細(xì)胞功能。
根據(jù)以上原理，我們可以通過(guò)軟件預(yù)測(cè)lncRNA與miRNA可能存在的靶向關(guān)系，再根據(jù)已知的miRNA與mRNA之間的調(diào)控關(guān)系，最終確定3者之前的網(wǎng)絡(luò)。ceRNA分析是基于lncRNA和mRNA的表達(dá)值，通過(guò)回歸模型分析篩選ceRNA對(duì)，與microRNA種子序列和lncRNA和mRNA匹配，這兩方面結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，建立microRNA的海綿吸附作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找到核心的ceRNA。有些算法同時(shí)考慮miRNA的表達(dá)【10】，但因?yàn)閏eRNA對(duì)miRNA只是吸附，并不一定影響miRNA本身的表達(dá)，所以也可以不去考慮。
ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)示例圖
3
lncRNA的編碼能力預(yù)測(cè)
高通量檢測(cè)手段（芯片或測(cè)序）能夠幫我們篩選到某種特定條件下特異性表達(dá)的lncRNA。當(dāng)我們拿到這條lncRNA后，除了在樣本中qRT-PCR驗(yàn)證其表達(dá)外，還需要分析其編碼能力：
CPC分析
CPC（Coding Potential Calculator）是一種蛋白質(zhì)編碼潛能計(jì)算工具，將轉(zhuǎn)錄本與已知蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)做blastx比對(duì)，依據(jù)轉(zhuǎn)錄本各個(gè)編碼框的生物學(xué)序列特征，通過(guò)支持向量機(jī)的分類(lèi)器來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)錄本的編碼潛能。
CNCI分析
CNCI（Coding-Non-Coding Index）是一種編碼-非編碼轉(zhuǎn)錄本區(qū)分工具，針對(duì)高通量測(cè)序之后得到的拼接轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行分析。該工具不依賴于已知的注釋文件，根據(jù)相鄰核苷酸三聯(lián)體特征區(qū)分序列的編碼和非編碼潛能。
pfam蛋白結(jié)構(gòu)域分析
利用pfamscan工具對(duì)序列在pfam HMM庫(kù)中進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域搜索，以篩除具有已知蛋白結(jié)構(gòu)域的序列。同時(shí)使用Pfam-A和Pfam-B庫(kù)，其中Pfam-A記錄了大部分已知蛋白結(jié)構(gòu)域、經(jīng)過(guò)人工篩選，質(zhì)量較高，而Pfam-B數(shù)據(jù)庫(kù)則更加全面的覆蓋了結(jié)構(gòu)域家族，是對(duì)Pfam-A的補(bǔ)充。將轉(zhuǎn)錄本各個(gè)編碼框上的蛋白序列與Pfam-A和Pfam-B數(shù)據(jù)庫(kù)做hmmscan的同源搜索，能比對(duì)上的序列即為具有某個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄本，被認(rèn)為具有編碼能力，而比不到的轉(zhuǎn)錄本極有可能是非編碼的轉(zhuǎn)錄本。
phyloCSF分析
PhyloCSF（Phylogenetic Codon Substitution Frequency）根據(jù)轉(zhuǎn)錄本的多物種全基因組比對(duì)結(jié)果，計(jì)算該序列密碼子替換頻率CSF（Codon Substitution Freuqencies，指某密碼子替換在多序列比對(duì)中的出現(xiàn)的頻率，編碼和非編碼區(qū)的密碼子替換頻率比值是一個(gè)有效區(qū)分一段序列能否編碼蛋白的方法），同時(shí)結(jié)合物種間系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上的距離，對(duì)轉(zhuǎn)錄本的編碼潛能進(jìn)行打分。
當(dāng)然，目前一些頂級(jí)期刊上發(fā)表的論文也證明了non-coding RNA能夠編碼特定多肽【11，12】，甚至有觀點(diǎn)認(rèn)為lncRNA能夠普遍編碼蛋白【13】，“非編碼”RNA的定義逐漸變得模糊。
4
lncRNA的調(diào)控機(jī)制驗(yàn)證
(1) RACE明確lncRNA序列
無(wú)論是芯片或者測(cè)序，很多情況下，我們是不能完全確定有一條lncRNA的全長(zhǎng)的。而lncRNA的序列信息，及其在一級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上形成的空間結(jié)構(gòu)，是決定其功能的重要基礎(chǔ)。因此，我們需要對(duì)其全長(zhǎng)進(jìn)行確認(rèn)。通常情況下，大家會(huì)通過(guò)3’RACE,5’RACE實(shí)驗(yàn)去確認(rèn)其全長(zhǎng)。有了全長(zhǎng)信息，我們會(huì)對(duì)該lncRNA有更加清晰的認(rèn)識(shí)。2017年有研究者將目標(biāo)RNA捕獲技術(shù)與三代測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，對(duì)整個(gè)GENCODE數(shù)據(jù)庫(kù)中人類(lèi)和小鼠基因間區(qū)的lncRNA進(jìn)行了重新注釋?zhuān)@部分全長(zhǎng)序列信息相信對(duì)lncRNA的研究人員有非常高的價(jià)值【14】。
(2) lncRNA在細(xì)胞內(nèi)的定位
雖然我們能夠利用各種生物信息學(xué)手段推測(cè)lncRNA可能的調(diào)控機(jī)制，接下來(lái)還可以先通過(guò)lncRNA在胞內(nèi)的定位，印證之前的生信分析是否成立。通過(guò)傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)手段便能夠確認(rèn)其細(xì)胞定位，來(lái)知道它主要在核內(nèi)，還是在核外。如果是核內(nèi)，那么，接下來(lái)考慮的作用方式可以就是染色質(zhì)調(diào)控，轉(zhuǎn)錄調(diào)控（結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)，和某些轉(zhuǎn)錄因子互作，Pol II的抑制子……）；如果是核外，那么，考慮的作用方式可能是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（影響mRNA的穩(wěn)定性，影響mRNA翻譯，作為miRNA的”sponge”……）。此外，一些數(shù)據(jù)庫(kù)比如RNALocate也可以幫助我們了解lncRNA的定位信息。
RNA FISH技術(shù)原位檢測(cè)lncRNA的定位【15】
(3) lncRNA與protein的結(jié)合
RIP，CLIP，RNA pull down等實(shí)驗(yàn)時(shí)也是驗(yàn)證RNA-Protein互作的常規(guī)手段。
(4)lncRNA-protein與下游靶基因的結(jié)合
lncRNA-protein最終會(huì)結(jié)合到下游靶基因的promoter區(qū)，因此這種結(jié)合關(guān)系可以通過(guò)ChIP來(lái)驗(yàn)證。
5
lncRNA的上游調(diào)控因子
大多數(shù)研究關(guān)注在lncRNA下游調(diào)控機(jī)制，lncRNA的上游調(diào)控機(jī)制也是十分重要的，一方面可以通過(guò)對(duì)多種類(lèi)型樣本和實(shí)驗(yàn)條件下的CHIPseq進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，預(yù)測(cè)lncRNA上游轉(zhuǎn)錄因子，或者直接借助數(shù)據(jù)庫(kù)（例如CHIPbase）；另一方面也可以通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合分析的方法，比如用Illumina 850k芯片同時(shí)分析基因組上lncRNA上游區(qū)域的甲基化變化，從而建立DNA甲基化-lncRNA的調(diào)控關(guān)系。
6
lncRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)
目前公開(kāi)的lncRNA相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)資源非常豐富，但是各個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)間的冗余、lncRNA命名方式的差異、ID號(hào)不統(tǒng)一等問(wèn)題一定程度上給研究人員來(lái)帶了諸多不便，這些問(wèn)題有待解決。一些比較實(shí)用的數(shù)據(jù)庫(kù)如下，可供參考。
7
lncRNA的功能研究
在經(jīng)典遺傳學(xué)理論中，無(wú)論是孟德?tīng)柸旧w分離與自由組合定律還是摩爾根染色體連鎖定律，基因和表型之間的關(guān)聯(lián)性始終貫穿其中。在現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究中，基因的表型往往影響了整個(gè)工作的完整性以及最終能夠達(dá)到的水平。這一點(diǎn)對(duì)于反向遺傳學(xué)而言更加如此。因此，基因表型的研究至關(guān)重要。腫瘤研究中，使用較多的表型研究策略包括RNA干擾以及最新的基因編輯系統(tǒng)CRISPR/Cas9系統(tǒng)
最近發(fā)展起來(lái)一種CRISPR干擾（CRISPR interference, CRISPRi）技術(shù)，將dCas9（核酸酶活性缺失的Cas9）和KRAB抑制結(jié)構(gòu)域融合在一起，所產(chǎn)生的融合蛋白能夠識(shí)別基因組上的靶位點(diǎn)，抑制基因表達(dá)而無(wú)需切割DNA。令人驚訝的是，有研究表明以這種方式沉默基因表達(dá)要比永久性地切割基因組具有更好的準(zhǔn)確性和更高的效率。CRISPRi主要是在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，可以阻礙RNA的轉(zhuǎn)錄起始，也可以抑制RNA的延伸，取決于sgRNA設(shè)計(jì)在promoter附近還是exon上。由于CRISPRi作用于特定的位置，因此可以通過(guò)將sgRNA設(shè)計(jì)在lncRNA的特異性序列上，從而盡可能避免干擾lncRNA的同時(shí)影響附近mRNA的表達(dá)。當(dāng)然，由于lncRNA與 mRNA的位置關(guān)系太過(guò)復(fù)雜，一些情況下仍難以單獨(dú)敲降lncRNA而不影響mRNA表達(dá)，比如bidirectional 類(lèi)型的lncRNA，或者 lncRNA的promoter與其它基因的promoter位置重疊或臨近。類(lèi)似的，如果將dCas9與一些轉(zhuǎn)錄激活域融合，則可以激活靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄，叫做CRISPR激活（CRISPR activation, CRISPRa），利用此技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)lncRNA的過(guò)表達(dá)。
CRISPRi技術(shù)原理示意圖
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