編譯：羅睺，編輯：夏甘草、江舜堯。
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導(dǎo)讀
隨著測序技術(shù)與生物學(xué)信息的不斷發(fā)展，從RNAseq數(shù)據(jù)中揭示長鏈非編碼RNA變得簡單可信。到目前為止，關(guān)于lncRNAs及其在茶葉中的調(diào)節(jié)作用還沒有系統(tǒng)的研究。本研究利用11個組織中的170個RNAseq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了33400個可推測的高確定性lncRNAs，其中99.76%被認(rèn)為是新的lncRNAs。對7個組織（腋芽、1芽和1葉、1芽2葉、頂芽和2葉、2thleaf、4thleaf和6thleaf）的53個RNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行了lncRNAs的表達(dá)分析，證實(shí)了它們的組織特異性表達(dá)。此外，約1654個lncRNAs被發(fā)現(xiàn)是miRNAs的內(nèi)源性模擬靶標(biāo)(eTMs)，與紅茶基因組的698個mRNAs相互作用?；谄浠蚓庉嫲閭H，GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)378個lncRNAs參與了茶香氣形成的主要途徑。本研究也為揭示lncRNAs調(diào)節(jié)茶葉香氣形成的各種分子功能提供了有價(jià)值的信息。
原名：Tissue specific long non-coding RNAs are involved in aroma formation of black tea
譯 名：組織特異性長鏈非編碼RNA參與紅茶的香氣形成
期 刊：Industrial Crops & Products
IF：4.244（2020年）
發(fā)表時間：2019.3
通訊作者：Tapan Kumar Mondal
通訊作者單位：印度新德里ICAR-植物生物技術(shù)國家研究中心
DOI號：10.1016/j.indcrop.2019.03.020.
鑒定茶lncRNAs RNAseq數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)集是從序列讀取檔案中下載(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/)代表11種不同的組織（種子、根、莖、腋芽、芽和葉、芽和葉、頂芽和2片葉、第2片葉、第4片葉、第6片葉和花，圖1）。首先，本研究開發(fā)了用于識別lncRNAs的生物信息學(xué)管道，如圖2所示。共170份RNAseq樣本，代表7個不同的葉組織（腋芽、1芽和1葉、1芽2葉、頂芽和2葉、2thleaf、4thleaf和6thleaf）中的lncRNAs差異表達(dá)進(jìn)行差異表達(dá)分析。然后，預(yù)測了可以作為miRNA前體的lncRNAs，鑒別lncRNA-mRNAs-miRNAs模塊，主要分析內(nèi)容有GO和KEGG注釋，紅茶lncRNAs全基因組比較分析，lncRNAs中轉(zhuǎn)座元件的組成，最后，驗(yàn)證了部分lncRNAs的qRT-PCR表達(dá)。圖1 茶葉不同部位的多種分析。
圖2 本研究中使用的紅茶lncRNAs鑒定管道預(yù)測的lncRNAs的鑒定與表征
設(shè)置了生物信息學(xué)管道分析了170個RNAseq數(shù)據(jù)（圖2）。大約43.69億個 reads （62.54%）成功地匹配到紅茶參考基因組上，并產(chǎn)生137429個基因座（156911個轉(zhuǎn)錄本）。這些轉(zhuǎn)錄本是在管家非編碼RNA的潛在前體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步過濾的，如miRNAs、短發(fā)夾RNA(ShRNA)、siRNAs和tRNAs。對lncRNAs的總長度、外顯子數(shù)和AU含量也進(jìn)行了表征。lncRNAs的長度從最小200 bp到最大14670 bp不等，平均長度為799 bp（圖3a）。大多數(shù)lncRNAs（75.6%）的長度<1000bp。共有1867例（5.58%）lncRNAs的長度大于2000bp。發(fā)現(xiàn)lncRNAs的平均長度遠(yuǎn)短于蛋白質(zhì)編碼基因的平均長度。lncRNA的平均長度與其它植物相似，如靈芝322bp到水稻800bp。大多數(shù)lncRNAs（97.95%）被發(fā)現(xiàn)含有單個外顯子（圖3b）。lncRNAs的AU含量從最低27%（TCONS U 00030583）到最高81%（TCONS U 00106220），大多數(shù)lncRNAs（96.5%）含有50%以上的AU。具體而言，317個lncRNAs的AU含量≥75%（圖3c）。
根據(jù)lncRNAs的基因組位置及其與最近蛋白編碼基因的接近程度，將鑒定出的lncRNAs分為三類：（1）基因間lncRNAs（距離>1kb，與蛋白編碼基因在兩條鏈上沒有重疊），（2）相鄰的lncRNAs（距離<1kb，蛋白質(zhì)編碼基因）和（3）基因lncRNAs（距離與蛋白質(zhì)編碼基因重疊）具有任意方向。根據(jù)這個標(biāo)準(zhǔn)，研究者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的lncRNA都是1型。67.53%位于任何注釋的茶基因模型的上游或下游鏈上，距離至少1 kb。大約5.6%的lncRNA為鄰接lncRNA，3.46%的在反義或有義方向上重疊。其余的lncRNA不能被分配到任何組，因?yàn)閮蓚€紅茶基因組都存在缺口。
lncRNA的差異表達(dá)分析
為了探究lncRNA的作用，作者對53份至少有2個生物學(xué)重復(fù)的RNAseq樣本進(jìn)行了差異表達(dá)分析。根據(jù)lncRNA的FPKM值對其進(jìn)行了分類。將lncRNAsFPKM閾值設(shè)置為5，1975個lncRNAs被確定為“全部表達(dá)”(即在7個組織中均表達(dá)，F(xiàn)PKM值≥5)，而12000個lncrna呈“混合表達(dá)”(在4個組織中低或高表達(dá))，1645個為組織特異性lncrna(僅在一個組織中表達(dá))。在2-6個FPKM值≤5的組織中，共有11,919個lncRNAs被至少表達(dá)，并被劃分為“Remaining”類別。此外，根據(jù)FDR值(pvalue≤0.05)和fold change≥2 (log2≥2)，共有7001個lncRNAs差異表達(dá)(圖4)。
表達(dá)上調(diào)的lncRNAs最多出現(xiàn)在頂芽和2片葉片上(Apb_2 L:2302個lncRNAs)。共發(fā)現(xiàn)1709個lncRNA在5個不同組織(6 L、Ab_1 L、Ab_2 L、Apb_2 L和Axb)的第2葉組織中上調(diào)，14個lncrna在其中4個組織中相互上調(diào)（Apb_2 L除外）。同樣，在6葉有1385個lncrna上調(diào)，分別為2 L、Ab_1 L、Ab_2 L、Apb_2 L和Axb。此外，1308在芽和葉(Ab_1 L)中上調(diào)，對應(yīng)的2 L、4 L、6 L、Ab_2 L、Apb_2 L和Axb，其中10和16個lncrna在相關(guān)組織中普遍上(圖S2d和S2e)。研究者在4個組織(Ab_1 L、Ab_2 L、Apb_2 L和Axb)中發(fā)現(xiàn)了1129個差異表達(dá)的lncRNA，而在這4個組織中只有1個lncRNA表達(dá)上調(diào)。對于腋芽(Axb)，只有477個lncrna被發(fā)現(xiàn)上調(diào)(原文圖S2)。
圖3 lncRNAs的特征:(A) lncRNAs的長度分布，(B) lncRNAs的外顯子分布，(C) lncRNAs的AU含量。圖4 茶樹（C. Sinensis）不同發(fā)育階段幼葉7001個lncRNA轉(zhuǎn)錄本的熱圖表達(dá)模式。[Axb = Axillary bud; Apb_2 L = Apical bud and 2 leaves; Ab_1L = a bud and a leaf; Ab_2 L = a bud and 2 leaves; 2 L = 2nd leaf; 4 L = 4th leaf; 6 L = 6th leaf]。lncRNA被預(yù)測為miRNAs的前體和誘餌
在lncRNA的眾多功能中，作為前體和誘餌的作用已被確定?？偣灿?3個lncrna被預(yù)測為紅茶15個miRNAs的前體。例如，TCONS_00078561被鑒定為CsnmiRn104的前體。此外，為了識別內(nèi)源性靶標(biāo)模擬物(endogenous target mimics, eTMs)，作者將預(yù)測的lncRNA與紅茶miRNA和mRNA進(jìn)行相互作用分析。共發(fā)現(xiàn)1654個lncRNA與紅茶473個miRNA相互作用。這些與lncRNA相互作用的miRNA進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn)與698種不同的中華支那mRNA作為推測的靶點(diǎn)相互作用。研究者檢測了miRNA和lncRNAs之間的兩種相互作用。它們是: i)單個lncRNA與多個miRNAs相互作用：例如，TCONS_00069314與11個不同的miRNA (CsnmiRn20, CsnmiRn26, CsnsmR31-3p, CsnmiRn70，CsnmiRn115,，CsnmiRn198, CsnmiRn358, CsnmiRn409, CsnmiRn439，CsnmiRn455, CsnmiRn472）（圖5a）；ii)與多個lncRNA相互作用的單個miRNA，如CsnmiRn372與61個不同的lncRNA相互作用(圖5b)。此外，本研究還鑒定了差異表達(dá)lncRNA的相互作用。圖5 | 相互作用網(wǎng)絡(luò)。(A)單個lncRNA與多個miRNA；(B)單個miRNA與多個lncRNA。圖6 | 基于GO的靶基因功能注釋。圖7 基于KEGG通路的靶基因分布研究GO 和 KEGG 分析結(jié)果
對預(yù)測的lncRNA進(jìn)行GO富集分析，根據(jù)GO注釋將其分為三組:生物學(xué)過程、分子過程、細(xì)胞過程。在698個目標(biāo)基因序列中，對468個序列進(jìn)行了134個基因本體術(shù)語標(biāo)記，并對134個目標(biāo)基因分配了98個EC號。并還對靶基因進(jìn)行了KEGG通路分析，發(fā)現(xiàn)共1109個基因涉及133個生物通路，其中40個通路涉及紅茶品質(zhì)，包含378個酶。在各種品質(zhì)形成途徑中，參與嘌呤代謝的酶最多(圖7)。紅茶lncRNA的比較分析
作者從CANT ATAdb, GreeNC, 和PNRD數(shù)據(jù)庫下載了所有可用的lncRNA序列用于對比分析。在紅茶中，只有81個lncRNAs與其他物種的125個lncRNAs具有同源性。所得到的lncRNA與其他物種具有相似性，可能與本研究中用于鑒定lncRNA的組織樣本和生物學(xué)管道不同有關(guān)。因此，有可能丟失了一些保守的lncRNA對。這些結(jié)果表明，在茶樹中預(yù)測的lncRNA可能是種特異性的。lncRNA中的轉(zhuǎn)座元件
研究者使用前人自定義 repeat libraries對預(yù)測的lncRNAs進(jìn)行Repeat Masking，以識別lncRNAs中的TE元素等特征。發(fā)現(xiàn)具有轉(zhuǎn)座元件的lncRNA之間有60.98%的相似性。未指定重復(fù)元件的比例較高(88.0%)。含有LTR/ gypsya的lncRNA所占比例小于含有LTR/ copia的lncRNA(圖8)。位于編碼基因附近的copia元件所占比例高于gypsytype元件。鑒定出含有其他逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的1.3%的lncRNA (I類:1.0% LINE, 0.3% sin)和5.3%的DNA轉(zhuǎn)座子(II類)，0.4%的簡單重復(fù)元件。圖8 | 重復(fù)元件在lncRNA中的分布
圖9 對所選lncRNA進(jìn)行Q-PCR分析。(A)驗(yàn)證所選lncRNAS(Illumina讀數(shù)的fold changes和QRT-PCR)在TV-1茶葉片組織中的表達(dá)分析；(B) 查爾酮異構(gòu)酶特異性lncRNAs相關(guān)的miRNA和在兩種不同組織中的表達(dá)分析（1芽兩葉和TV-1的 4th葉）。隨機(jī)選擇的lncRNA進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證
為了驗(yàn)證RNA-seq數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析得到的表達(dá)數(shù)據(jù)，研究者使用基因特異性引物對15個隨機(jī)選擇的組織特異性lncRNA(基于它們的FPKM值)進(jìn)行qRT-PCR。結(jié)果顯示，15個lncRNA中有10個的表達(dá)趨勢與對應(yīng)的FPKM值相似(圖9a)。在本次分析中5個lncRNA是否缺失尚不清楚，可能是基因型差異、剪接選擇性等因素造成的。然而，這個結(jié)果清楚的表明了通過生物信息學(xué)分析得到的數(shù)據(jù)是非?？尚诺?，通過qRT-PCR分析15個lncRNAs中有10個表達(dá)了相似的趨勢。lncRNA與茶葉次生代謝產(chǎn)物途徑的關(guān)聯(lián)
紅茶香氣的形成與其次生代謝物相關(guān)。雖然芳香是由于一些揮發(fā)性化合物的存在而形成的，但實(shí)際上一些主要的感官形成成分是咖啡因，兒茶素或多酚。這些因素共同決定了紅茶的質(zhì)量。因此，為了研究lncRNAs在香氣形成化合物生物合成途徑中的作用，作者對目標(biāo)mRNA進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)lncRNAs參與了大約40種不同的相關(guān)生物合成途徑。其中嘌呤生物合成途徑、咖啡因生物合成途徑、苯基丙醇生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、異黃酮生物合成途徑以及其他幾種揮發(fā)性化合物(萜類、亞油酸、二萜、香葉、單萜、核黃素等)的生成途徑在本研究中被認(rèn)為是lncRNA的靶向結(jié)果。其中，苯丙氨酸途徑以苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥化酶和4-香豆酸:輔酶A連接酶三種主要速率限制酶合成茶葉中重要的次生代謝產(chǎn)物。有趣的是，在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)該通路的12種酶是不同的lncRNA靶標(biāo)。其中l(wèi)ncRNA TCONS_00052382、TCONS_00050120、TCONS_00052690、TCONS_00050120與PAL相互作用，TCONS_00133884與4CL酶相互作用，提示這些lncRNA可能調(diào)控這兩個基因的表達(dá)。
嘌呤代謝直接參與茶葉香氣的形成。在本研究中，根據(jù)lncRNA-mRNA的相互作用，研究發(fā)現(xiàn)最多有37個lncRNA具有該途徑的各種酶靶，其中包括兩條咖啡因合成途徑?？Х纫虮徽J(rèn)為是存在于茶中的嘌呤生物堿和形成香味的化學(xué)物質(zhì)。茶葉含有大量的咖啡(2%)，咖啡因是通過這一途徑的主要酶產(chǎn)生的。然而，作者沒有發(fā)現(xiàn)咖啡因生物合成基因主要速率限制酶的lncRNA。
苯丙途徑的另一個重要衍生物是類黃酮生物合成，其中兒茶素是重要的類黃酮化合物之一。
茶葉中兒茶素含量較高，但幼葉含量高于老葉。大約20個lncRNA被發(fā)現(xiàn)與7組20種酶相關(guān)，這表明lncRNA-mRNA的關(guān)聯(lián)具有副特異性(圖10)。其中只有一個網(wǎng)絡(luò)與miR5021 A有關(guān)聯(lián)。為了進(jìn)一步了解其關(guān)聯(lián)模式，研究者對查爾酮異構(gòu)酶模塊進(jìn)行了qRT-PCR分析。在4個lncRNA中，發(fā)現(xiàn)3種不同的反應(yīng)(9b)；（1）在TCONS_00090099-CHI-CSA006623.1-miR5021網(wǎng)絡(luò)中，lncRNA和mRNA的表達(dá)水平相似的組織而microrna的表達(dá)趨勢是相反，表明lncRNA在年輕的葉子中充當(dāng)誘餌，這樣查耳酮異構(gòu)酶可以調(diào)節(jié)產(chǎn)生更c(diǎn)atechine生產(chǎn)。（2）在TCONS_00046841-CHICSA008262.1組合中,兩者均有逆向表達(dá)趨勢，表明 lncrna 可能利用DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)機(jī)制作用于其靶標(biāo)。這種調(diào)控方式在lncRNA很常見。（3）TCONS_00000187-CHI-CSA023536.1組合，同樣有相似的趨勢。這也表明這些lncrna在茶的兒茶素生物合成中發(fā)揮了重要作用。這說明lncRNA在茶葉品質(zhì)性狀調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。非編碼RNA是最近發(fā)現(xiàn)的一組分子，它們參與了多種生物途徑中的基因調(diào)控。幾種類型的非編碼RNA調(diào)節(jié)植物中不同性狀的基因表達(dá)，其中l(wèi)ncRNAs是最近發(fā)現(xiàn)的具有多種功能的非編碼RNAs，主要有兩種機(jī)制：作為miRNAs的前體或作為eTM阻斷miRNA的功能。在植物和動物中，lncRNA可作為誘餌，也被稱為內(nèi)源性靶向模擬物（eTM）或競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA）。研究人員正在使用從lncRNAs特定庫生成的高通量測序數(shù)據(jù)來發(fā)現(xiàn)lncRNAs。另一方面，可從公開的RNAseq數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)lncRNAs，生成lncRNAs特定庫。相關(guān)研究人員已從幾種植物物種中發(fā)現(xiàn)并表征了lncRNAs，但尚未在茶葉中進(jìn)行研究。因此，在本研究中，研究者利用公開的RNAseq數(shù)據(jù)來發(fā)現(xiàn)茶葉中的lncRNAs。茶葉的價(jià)值在于其唯一的經(jīng)濟(jì)部分，但理解茶葉香氣（質(zhì)量成分）形成的分子機(jī)制一直是一個挑戰(zhàn)。質(zhì)量是一個多基因特性，因此受到包括lncRNAs和環(huán)境因素在內(nèi)的多種基因組資源的控制。因此，鑒定存在于茶葉幼組織中的lncRNAs是了解其在組織發(fā)育和茶葉品質(zhì)參數(shù)綜合中的作用的先決條件。因此，本研究旨在實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。本文分析從RNAseq數(shù)據(jù)中得到了一個相對較好的（33400）個潛在的lncRNAs，其中33319個被發(fā)現(xiàn)是新的。這些lncRNAs將為今后茶葉功能基因組學(xué)研究提供有用的基因組資源。組織特異性基因表達(dá)是導(dǎo)致組織功能多樣性的原因之一，本研究發(fā)現(xiàn)1645個（4.92%）的lncRNAs在7種不同的茶幼組織中特異表達(dá)。在水稻、二穗短柄草、鷹嘴豆、擬南芥和銀杏中發(fā)現(xiàn)了類似種類的組織特異性lncRNAs。不同類型的lncRNAs如基因間lncRNAs、相鄰lncRNAs和重疊lncRNAs的外顯子數(shù)目不同，其長度變化具有不同的功能。在本研究序列分析中，作者發(fā)現(xiàn)一些lncRNAs可能參與茶葉香氣的形成。雖然lncRNAs可能通過多種機(jī)制發(fā)揮作用，但它們大多起到了誘餌的作用，這在本研究中是很有潛力的。然而，一個lncRNAs TCONS_00000187-CHI-CSA023536.1與其靶點(diǎn)有相似的表達(dá)趨勢。雖然原因尚不清楚，但作者假設(shè)可能存在一些miRNAs，該lncRNA可作為誘餌，但由于目前的茶葉基因組中存在缺口，因此不用于本分析。目前，我們的miRNA分析僅限于已發(fā)表的miRNA。圖10 兒茶素生物合成途徑。藍(lán)色粗線上方的面板是苯基丙烷途徑，底部面板是類黃酮途徑雖然eTM已經(jīng)在一些植物中得到鑒定，但是它們在控制基因表達(dá)方面的特殊作用并沒有得到很好的研究。最近張等人確定了沙棘果實(shí)成熟過程中花青素生物合成的幾種差異表達(dá)的lncRNAs。在本研究中，作者鑒定出698個lncRNAs是eTM，它們與多種次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑有關(guān)，這些途徑幾乎涵蓋了紅茶香氣形成（品質(zhì)）的所有主要生物合成途徑。利用公開的RNAseq數(shù)據(jù)，研究者已經(jīng)鑒定出33400個紅茶的lncRNAs，其中33319個是新的。在33400個lncRNAs中，22556個、1889個和1152個lncRNAs分別是基因間的、相鄰的和重疊的。研究者還發(fā)現(xiàn)1645個lncRNAs在7個不同的茶葉幼組織中有差異表達(dá)，其中一些可能對泡茶品質(zhì)起重要作用。有趣的是，大約20368（60.98%）的lncRNAs與各種轉(zhuǎn)座元件有關(guān)。大量轉(zhuǎn)座元件的存在反映了茶葉基因組具有高重復(fù)區(qū)域（高于80%）的事實(shí)。幾種lncRNAs與茶葉的各種次生代謝途徑有關(guān)，可以調(diào)節(jié)茶葉香氣的形成?？偟膩碚f，本研究已經(jīng)對茶葉中的lncRNAs進(jìn)行了分類，其中一些可能對香氣形成有重要作用，并將為今后研究其在茶葉基因表達(dá)中的調(diào)控作用提供重要的基因組資源。影響泡茶質(zhì)量的因素取決于茶葉組織、環(huán)境因素、基因型和植物的年齡。香氣是決定紅茶品質(zhì)的一個重要指標(biāo)，主要由內(nèi)源酶如β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生。香氣的形成有多種途徑。lncRNAs在基因表達(dá)中起著關(guān)鍵作用，在植物中控制各種非生物和生物性狀表達(dá)的作用。本文主要研究了lncRNAs在茶葉幼葉中的差異表達(dá)，有助于更好地了解其在香氣形成中的作用。本文首次報(bào)道了茶葉中l(wèi)ncRNAs的發(fā)現(xiàn)和性質(zhì)，并對其與紅茶香氣形成的關(guān)系進(jìn)行了研究，對茶葉品質(zhì)研究提供重要的基因組資源。
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