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編譯：熱血本能，編輯：十九、江舜堯。

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1. 結(jié)構(gòu)和內(nèi)容

1.1 circAtlas的構(gòu)造和功能

circAtlas的構(gòu)建基于對1070個RNA-seq數(shù)據(jù)集中的circRNA的全面分析，其中包括使用六種脊椎動物（人類，獼猴，小鼠，大鼠，豬和雞）收集的19種正常組織， 基于生物信息學的最新方法。circAtlas的內(nèi)容和結(jié)構(gòu)如圖1所示。簡單地說，每個物種的circRNAs是通過四種檢測算法來識別的，分別是CIRI2, find_circ, CIRCexplorer2, DCC，這些算法在之前的研究中得到了廣泛的應(yīng)用和測試。然后使用CIRI-full / CIRI-vis管道重建已鑒定circRNA的全長序列。然后，對全長環(huán)狀RNA進行內(nèi)部核糖體進入位點(IRESs)和ORFs的搜索，以預(yù)測其編碼潛能。同時使用多重保守評分（MCS）方案對circRNA的保守性進行了表征，該方案可估計circRNA在三個水平上的保守性，包括物種，組織和個體?；?/span>MCS，引入了一個ID分配方案，其中包括每個circRNA的信息，包括物種，保守和宿主基因。作者接下來將共表達網(wǎng)絡(luò)，circRNA-miRNA和RBP結(jié)合位點的信息結(jié)合起來，以提供這些circRNA的全面注釋。GO和KEGG數(shù)據(jù)庫用于預(yù)測這些環(huán)狀RNA的潛在功能。同時，將circad、circR2Disease、circRNADisease管路集成到circAtlas中，評價circRNAs與各種疾病的相關(guān)性。為了促進circAtlas的廣泛使用，作者還開發(fā)了一個用戶友好，交互式且開放訪問的Web門戶，用于查詢和可視化circRNA及其注釋。門戶將環(huán)狀RNA的列表或序列作為輸入。如果查詢circRNAs已經(jīng)包含在circAtlas中，用戶可以瀏覽并立即下載它們的序列、表達式概要和注釋。否則，服務(wù)器將查詢跨物種的新環(huán)狀RNA的標準，執(zhí)行功能性注釋，并基于綜合注釋對候選環(huán)狀RNA進行優(yōu)先級排序。circAtlas數(shù)據(jù)庫的web應(yīng)用程序是使用MySQL v.5.6.38和PHP v.7.0開發(fā)的。circAtlas的全部內(nèi)容都是免費提供的，可以從網(wǎng)站(http://circatlas.biols.ac.cn/)下載。

圖一：circAtlas的內(nèi)容和構(gòu)造

1.2  CircRNA檢測和全長轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建

智人，獼猴，小家鼠，褐家鼠，Sus scrofa和蓋氏雞的參考基因組的裝配版本分別為hg38，rheMac8，mm10，rn6，susScr11和galGal4。這些文件是從GENCODE和Ensembl下載的。對于每個RNA-seq數(shù)據(jù)集，使用了四種不同的circRNA檢測工具，包括CIRI2、DCC、CIRCexplorer2和find_circ，并使用了默認參數(shù)。至少兩種工具檢測到的環(huán)狀RNA和至少兩種獨立的BSJ reads支持的環(huán)狀RNA被保留下來用于下游分析。研究發(fā)現(xiàn)，每個物種平均產(chǎn)生167,847個環(huán)狀RNA。同時，利用既有的circRNA反向重疊信息，又利用CIRI-AS檢測到的circRNA的內(nèi)部態(tài)勢，利用CIRI完整的管線重建全長circRNA轉(zhuǎn)錄本。因此，平均每個物種獲得136,467個全長環(huán)狀RNA。最后，該研究者實現(xiàn)了每百萬個映射片段（FPM）值的反剪連接作為circRNA表達水平的定量替代。

1.3  表達同源環(huán)狀RNA的同源基因的鑒定

進化分析對于深入了解功能篩選的遺傳基礎(chǔ)至關(guān)重要。因此，作者基于同源基因在這6個物種中鑒定出進化保守的環(huán)狀RNA。簡而言之，從OMA ortholog數(shù)據(jù)庫下載成對的同源基因列表，使用基因組注釋文件確定每個物種在這些同源基因上的環(huán)狀RNA。隨后僅保留表達環(huán)狀RNA的同源基因?qū)M行保守環(huán)狀RNA檢測。接下來，從整個基因組比對中確定同源基因?qū)χ?/span>cirexon對的邊界，即參與環(huán)狀rna形成的外顯子。這些從UCSC和Ensembl下載的比對結(jié)果用于確保下游分析中保守的環(huán)狀RNA鑒定的準確性。為了檢測來自這些cirexons的保守環(huán)狀RNA，作者從相應(yīng)的cirexons中提取了環(huán)狀RNA BSJ兩側(cè)各50 bp的片段，用來表示BSJ序列。使用BLAT將一個物種的所有circRNA BSJ序列與其他物種的序列進行比對，然后采用最佳互反策略找到同源環(huán)狀RNA。然后，使用multisoar v2.0軟件，使用組合的方法構(gòu)建ortholog組，對互反的最佳成對的正態(tài)環(huán)狀RNA進行整合。最后，篩選出最匹配的同源環(huán)狀RNA進行下游分析。通過對6個物種中每一個物種的環(huán)狀RNA進行這一流水線操作，在任意兩個物種中鑒定出129,635個進化保守的環(huán)狀RNA，其中797個在6個物種中都是保守的。

圖2：在六個脊椎動物中的表達情況和直系circRNA

1.4  circRNA保守性分析

由于保守通常被認為是優(yōu)先考慮功能候選基因的標準，因此作者建議使用MCS在物種，組織和個體（或樣品）水平上評估circRNA的保守性。計算公式為:MCS = N s + Nt Ni。簡單地說，對于物種中給定的circRNA，這個公式包含了數(shù)字的兩部分:整數(shù)部分和小數(shù)部分。整數(shù)部分，表示物種間環(huán)狀RNA的守恒，是這個環(huán)狀RNA(Ns)的標準數(shù)。小數(shù)部分Nt×Ni，代表跨組織和個體的circRNA保守性，是通過構(gòu)建層次表達樹來計算的，其中跨組織和個體的circRNA表達模式可以用兩層內(nèi)部的層次結(jié)構(gòu)。組織和各個層中的節(jié)點分別代表特定物種中的組織和個體。然后，此小數(shù)部分的分數(shù)由Nt×Ni計算。

2. 效用和討論

2.1 提高了circRNA保存分析的分辨率

為了全面研究環(huán)狀RNA的保守情況，作者使用MCS來評估環(huán)狀RNA在不同物種、組織或個體之間的保守情況。簡而言之，對于每一個circRNA，通過加入組織和個體的歸一化發(fā)生率與相應(yīng)圓形轉(zhuǎn)錄本的正態(tài)數(shù)的乘積，得到MCS。為了驗證該方法的性能，作者研究了每個物種在5 - 6個窗口內(nèi)的環(huán)狀RNA的MCS分布。因此，作者觀察到MCS在物種、組織和個體水平上有明顯的與circRNA保護正相關(guān)的趨勢。對其他隨機選擇的窗口也觀察到同樣的趨勢。這些結(jié)果表明MCS是分析環(huán)狀RNA保存的一個有效參數(shù)。在成功地將保守分數(shù)分配給環(huán)狀RNA后，對每個物種的MCS分數(shù)分布進行了分析。作者發(fā)現(xiàn)，circRNA轉(zhuǎn)錄進化迅速，在單個物種或親緣關(guān)系較近的物種中均有表達，其中每個物種中大部分circRNA的MCS均低于2.0?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明MCS方案能夠提高circRNA保守分析的分辨率，并將極大地促進候選環(huán)狀RNA的優(yōu)先排序。例如，在circAtlas數(shù)據(jù)庫中記錄了來自YAP基因的65個環(huán)狀RNA。作者根據(jù)這些環(huán)狀RNA的MCS對其進行排序，發(fā)現(xiàn)其中最保守的hsa-YAP1_0001在5種脊椎動物和12種組織中均有表達，這表明它可能與重要的生物學功能有關(guān)。事實上，已有研究表明，通過抑制翻譯起始機制的裝配，hsa-YAP1_0001可以拮抗YAP的翻譯。

圖三：circRNA保守性分析的新型定量分析

2.2 circRNA亞類的綜合研究

為了更好地了解環(huán)狀RNA的多樣性，作者根據(jù)環(huán)狀RNA與已知遺傳成分和轉(zhuǎn)錄方向的重疊程度，將環(huán)狀RNA分為7組，包括外顯子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、基因間區(qū)、5 -UTR、3 -UTR、非重復區(qū)和反義區(qū)。值得注意的是，作者引入了一種新的circRNA，稱為非重復序列，其中在某些circRNA的兩個側(cè)翼內(nèi)含子上沒有已知的重復序列（如RepeatMasker數(shù)據(jù)庫中記錄的那樣）。這種環(huán)狀RNA可能是通過結(jié)合RBPs而產(chǎn)生的，而不是通過內(nèi)含子中側(cè)翼重復序列的匹配產(chǎn)生的。作者首先根據(jù)這種分類來評估已識別環(huán)狀RNA的組成。與之前的研究結(jié)果一致，環(huán)狀RNA主要來源于帶注釋的外顯子，對編碼序列和5 -UTR外顯子有明顯的偏好。作者進一步對這7種環(huán)狀RNA的表達模式和序列長度進行了詳細的分析。值得注意的是，在這種情況下，外顯子環(huán)狀RNA常被用作所有比較的對照。原則上，反義RNA和內(nèi)含子環(huán)狀RNA在所有比較病例中表達水平最低。此外，該測量與其他類型的circRNA沒有定量區(qū)別。然而，這些環(huán)狀RNA在人類和其他生物的組織特異性、連接比、序列長度等方面都有明顯的區(qū)別。在比較的亞類中，反義環(huán)狀RNA最為明顯，組織特異性最高，連接比最低，序列長度變異最大?？紤]到反義環(huán)狀RNA的轉(zhuǎn)錄方向與其宿主基因相反，并且可能作為感覺mRNA的調(diào)控因子，作者推測其表達模式可能與其宿主基因高度相關(guān)。然而，作者發(fā)現(xiàn)反義環(huán)狀RNA和它們的宿主基因之間的Pearson相關(guān)系數(shù)大多在0.1到0.5之間變化，這是相關(guān)性不高或低的一個指標。非重復環(huán)狀RNA在所有比較的病例中均保持中等水平的表達和組織特異性，但序列長度最短的病例除外。

作者隨后研究了這些不同的環(huán)狀RNA亞類在進化過程中被保留的機制。作者檢查了這6種脊椎動物中存在的同源環(huán)狀RNA，并計算了擁有相同序列的同源環(huán)狀RNA的數(shù)量以及它們祖先節(jié)點上的BSJs和共享基因的數(shù)量。如圖4f所示，隨著物種間遺傳距離的增加，共享的同源環(huán)狀RNA和BSJs的數(shù)量迅速減少。相比之下，同源同源mRNA的減少要慢得多，這表明雖然同源同源同源mRNA來自于相同的基因，但不同物種的環(huán)狀RNA在序列和BSJs上分化迅速。然后，計算這些節(jié)點上的每個同源circRNA子類的數(shù)目，以及每個子類在進化過程中所占的比例。如圖4g所示，反義亞類的比例急劇下降，其次是基因間區(qū)、非重復區(qū)和3 -UTR區(qū)。許多內(nèi)含子環(huán)狀RNA在這些生物體中高度保守，即使是遠親物種也如此，在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出更強的選擇約束。此外，作者還研究了這些節(jié)點中的環(huán)狀RNA的表達模式是否在不同組織中發(fā)生變化，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA具有高度的組織特異性，并且在大腦中主要表達。

圖四 環(huán)狀RNA不同亞類的表征

2.3 環(huán)狀RNA的大規(guī)模功能性注釋

構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)后，作者首先調(diào)查了可能與circRNA相互作用的RBP或miRNA。然后，根據(jù)與這些RNA相關(guān)的環(huán)狀RNA的數(shù)量對它們進行排序。作者發(fā)現(xiàn)前10位RBPs在轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)功能上高度富集，如U2AF2和PTBP1。最常與環(huán)狀RNA結(jié)合的miRNAs被鑒定為hsa-miR-711和hsa-miR-608，它們可能在環(huán)狀RNA調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)環(huán)狀RNA對不同miRNA的結(jié)合位點數(shù)量非常有限，而對同一miRNA的結(jié)合位點數(shù)量卻非常有限。然后作者提取了最豐富的10個KEGG術(shù)語，發(fā)現(xiàn)最多數(shù)量的帶注釋的環(huán)狀RNA參與了疾病相關(guān)功能，如癌癥、白血病和前列腺癌中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)。這表明環(huán)狀RNA可能在疾病條件中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。為了進一步證明circAtlas進行circRNA注釋的可靠性，作者將它們與circad，circR2Disease和circRNADisease中記錄的與疾病相關(guān)的circRNA的手動處理進行了比較。因此，作者發(fā)現(xiàn)這些數(shù)據(jù)庫之間共享了456個環(huán)狀RNA，其中大部分得到了以前實驗注釋的良好支持。

圖五：基于環(huán)狀RNA、mRNA、miRNAs和RBP集成網(wǎng)絡(luò)的環(huán)狀RNA注釋

為了彌合絕大多數(shù)circRNA及其生物學功能之間的巨大鴻溝，作者從包括人，獼猴，小鼠，大鼠，豬和雞在內(nèi)的六個脊椎動物中收集了一個完整的circRNA庫，稱為circAtlas。作者整合了1070個轉(zhuǎn)錄組，生成了超過100萬個環(huán)狀RNA的綜合圖譜，以及這6種脊椎動物多個組織的表達譜。評估了物種、組織和個體中每個環(huán)狀RNA的保存情況。將共表達譜與miRNA相互作用和RNA結(jié)合蛋白(RBP)相互作用數(shù)據(jù)結(jié)合，對環(huán)狀RNA進行功能注釋。因此，circAtlas可以用作全面的功能性circRNA資源，以有效地瀏覽，注釋和區(qū)分circRNA的優(yōu)先級，并提供有關(guān)其保守性和功能的見解。

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