基因敲除細胞或動物模型一直以來是開展基因功能研究的重要工具。近年來，隨著CRISPR/Cas9系統的發(fā)現，憑借其高效、便捷的Knock out效果，迅速風靡科研界，廣泛應用于研究基因的功能及表達調控機制的研究中。今天就為大家介紹一下基因敲除鼠的構建過程。
CRISPR/Cas9基因敲除鼠構建流程圖如下，今天重點介紹下基因敲除鼠的體外受精-顯微注射-胚胎移植部分:
一
卵母細胞的采集
(1)取21天的雌鼠，腹腔注射孕馬血清促性腺激素PMSG 50ul,以促進卵泡發(fā)育。
(2)46h后注射人絨毛膜促性腺激素HCG 50ul，以促進排卵。
(3)注射HCG后大約16h(約在受精日上午10點左右)將雌鼠安樂死，從輸卵管壺腹部(膨大部位)采集卵母細胞。如圖所示，將輸卵管部分取出，置于液滴內，用注射針輕輕劃開，可見一團團顆粒細胞包裹的卵細胞團，將卵細胞團置于受精液滴中。
二
受精液滴配置
受精前一天，配制獲能液滴，受精液滴，培養(yǎng)液滴，在35mm培養(yǎng)皿中滴加液滴后用無菌石蠟油完全覆蓋(不完全覆蓋液體可揮發(fā))，過夜預平衡。
三
精子的采集與獲取
1)受精日早上八點左右，將雄鼠安樂死之后，取出附睪，用無菌眼科剪剪出缺口，置于HTF獲能液滴中，使精子自缺口處游出，將培養(yǎng)皿置于37℃、5%C02中培養(yǎng)箱內放置約2h,使精子獲能。
2)將獲能后的精液轉移到含有卵母細胞的受精液滴中,注意在加入精子前注意觀察鏡子活力，濃度。操作過程中注意事先用剪刀剪出的鈍性槍頭，然后置于酒精等烘烤使槍頭頂端圓滑，緩慢吸取20ul左右獲能精液加入到受精液滴中，觀察精子活力與濃度，精子活力低可適量多加，但也要注意避免精子濃度過高，放止多精受精發(fā)生。
四
體外受精
含有卵母細胞和獲能精子的HTF液滴置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中孵育6~8h,使其完成體外受精。約下午四點左右，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿;用HTF液洗滌處理后的卵母細胞，去除周圍的精子以及顆粒細胞。此時,受精后的卵母細胞可以觀察到第二極體以及原核，稱為原核期受精卵。
五
顯微注射
原核期受精卵內通過顯微注射技術將體外轉錄后獲得的cas9 -sgRNA的mRNA注射入原核內。然后將受精卵置于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中孵育。
六
胚胎移植
受精卵體外培養(yǎng)至2細胞時可移植至假孕母鼠輸卵管傘部開口處。當體外培養(yǎng)到囊胚時，可直接將囊胚移植至假孕期母鼠(約第4天)子宮內。注意移植時受體母鼠的合籠后日期相對應。如移植2細胞在受體母鼠合籠日次日，囊胚移植則需在受體母鼠合籠后第4日，使受體母鼠身體內妊娠狀態(tài)時間與體外受精發(fā)育時間盡量相近。
七
假孕受體母鼠制備
1)結扎公鼠:取大于八周的公鼠，進行腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，注射劑量按0.01ml/g計算。公鼠麻醉后，切開腹部切口，尋找到附睪，將其結扎或切除。結扎公鼠至少單獨飼養(yǎng)休息至傷口完全愈合后用于交配。
2)取已生育的六周齡以上雌鼠，第一天注射PMSG 70ul(成熟雌鼠用量高于21周雌鼠)，46h后注射HCG 50ul后與公鼠合籠。
3)移植日清晨檢栓，合籠過的雌鼠陰道口可見陰道口潮紅，內見黃白色栓，則雌鼠尾假孕狀態(tài)。將雌鼠麻醉，腹部開口，于顯微鏡下尋找卵巢與輸卵管開口。注意操作過程中輕輕劃開輸卵管與卵巢表面包囊，放止損傷卵巢。
4)將2細胞輕輕吹入輸卵管傘部開口處，縫合腹部切口。
5)移植后雌鼠注意保暖(可用燈泡照射或者電熱毯取暖)，幾小時后雌鼠麻醉恢復，可活動。
6)移植后21天左右，觀察是否有小崽出生。若出生，約出生后7天左右剪腳趾并編號，鑒定小崽基因型，測序驗證基因序列是否改變。
基因敲除動物模型的制備流程大概就是這樣了，然而真正得到基因敲除鼠還需要后期不斷的篩選純化基因型，得到純合的基因敲除鼠。道路阻且長，且敲且珍惜。只能感慨:敲除小鼠來之不易啊!
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