之前關(guān)于靶向RAS，請(qǐng)參考推送：將軍三箭定天山 不克RAS誓不還
近期基因泰克的Shiva Malek及合作伙伴在Nature Reviews Drug Discovery發(fā)表了題為《RAS- targeted therapies: is the undruggable drugged?》的綜述，有些有意思的變化，分享給大家：
RAS（KRAS、NRAS和HRAS）是腫瘤中最常見的突變基因家族，因此近30年來研究人員也為尋找有效的RAS抑制劑而苦苦探索了30載。即便在10年以前，RAS抑制劑也是很難開發(fā)，因?yàn)?/span>RAS也被打上了不可成藥的標(biāo)簽。但現(xiàn)在隨著靶向NSCLC中最主要的突變類型KRASG12C的等位基因特異的共價(jià)抑制劑的成功開發(fā)，使得我們有機(jī)會(huì)來評(píng)估RAS驅(qū)動(dòng)的腫瘤的最佳治療策略。突變本身的生化特征和腫瘤原發(fā)病灶都有可能會(huì)影響這類治療的效果。現(xiàn)在通過等位基因特異抑制劑來直接靶向抑制RAS成為首選的治療選擇，而靶向RAS活化通路或RAS效應(yīng)通路的策略可以和直接的RAS抑制劑、免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向T細(xì)胞的療法聯(lián)合來治療RAS突變的腫瘤。這里回顧了靶向RAS突變蛋白的治療的進(jìn)展，并討論了包括聯(lián)合策略在內(nèi)的這些療法在將來的挑戰(zhàn)。
正文
1 RAS突變及剪接變體
2 RAS突變的生化特征
3 直接靶向RAS的方法
4 非直接靶向RAS的策略
5 新興療法
5.3.1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑
5.3.2 過繼細(xì)胞療法
5.3.3 腫瘤疫苗
6 未來發(fā)展方向與小結(jié)
正文
RAS（KRAS、NRAS和HRAS）是腫瘤中最常見的突變基因家族，而KRAS的突變也引起包括肺癌、腸癌和胰腺癌這三種最常見的腫瘤。三十年來致力于開發(fā)有效的療法來抑制RAS驅(qū)動(dòng)的腫瘤的努力也多以失敗告終，因此RAS也被認(rèn)為不可成藥（undruggable）。但是隨著近來FDA授予等位基因特異的共價(jià)抑制劑AMG 510快速通道資格認(rèn)定(FTD)，這個(gè)獲批臨床的針對(duì)特定的KRAS突變的療法開始進(jìn)入大家視線。AMG 510結(jié)合并成功抑制NSCLC中最常見的RAS突變類型KRAS-G12C，也提高了靶向治療更多的RAS突變類型的希望。
在正常的細(xì)胞中，RAS處于如EGFR這種生長因子受體的下游，是一類分子開關(guān)的小GTPase，在結(jié)合GTP的活化形式和結(jié)合GDP的非活化形式間切換。盡管RAS能內(nèi)源性的水解GTP和交換核苷酸，但是細(xì)胞信號(hào)主要還是靠鳥苷酸交換因子（GEF）催化加載GTP來活化，通過GTPase活化蛋白（GAP）加速GTP的水解來觸發(fā)信號(hào)通路的失活。在結(jié)合GTP的狀態(tài)下，RAS可以通過直接作用并活化包括MAPK和PI3K通路在內(nèi)的多條下游效應(yīng)通路。RAS突變通常能破壞鳥苷酸交換，能夠非GAP依賴的將RAS鎖定在結(jié)合GTP的活化狀態(tài)，因此可以持續(xù)活化下游信號(hào)通路來引發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖。
在這份綜述中，我們介紹在近來在針對(duì)突變的RAS蛋白的靶向治療的開發(fā)上的進(jìn)展并討論了潛在可能提升臨床效果的聯(lián)合治療策略：1）首先討論了不同的RAS突變類型及生化性質(zhì)上的差異；2）然后回顧了近來的直接或間接地抑制RAS的策略，特別重點(diǎn)介紹靶向KRAS G12C的突破性療法及阻斷SOS1、SHP2的抑制劑；3）更新了靶向RAS自身及下游信號(hào)通路中效應(yīng)蛋白的的抑制劑的臨床進(jìn)度；4）最后詳細(xì)列舉了治療RAS突變的腫瘤的新策略。
1 RAS突變及剪接變體
RAS突變是包括結(jié)直腸癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、肺腺癌、黑色素瘤和特定血液腫瘤在內(nèi)的多個(gè)癌種的遺傳驅(qū)動(dòng)因子。雖然上述腫瘤都可由RAS突變驅(qū)動(dòng)，但是RAS異構(gòu)體類型（KRAS、NRAS或HRAS）、突變密碼子及突變頻率因組織類型而差異很大。比如大部分的肺腺癌、胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）和結(jié)直腸癌由KRAS突變驅(qū)動(dòng)，分別占到32%、86%和41%，其中最主要的是密碼子12位的突變，分別85%、91%和68%。對(duì)比之下，29%的黑色素瘤由NRAS而非KRAS的突變驅(qū)動(dòng)，這些突變85%通常發(fā)生在密碼子第61位。HRAS突變發(fā)生的頻率通常低于KRAS和NRAS，但特定亞型的頭頸癌（5%）和膀胱癌（6%）是由HRAS突變驅(qū)動(dòng)，通常也是發(fā)生在第12和61位密碼子?；蚬こ绦∈竽Ｐ停℅EMMs）能夠重現(xiàn)在患者中發(fā)現(xiàn)的RAS家族成員突變及密碼子突變偏好。例如在結(jié)腸上皮細(xì)胞中Kras G12D表達(dá)可以引起過度增殖，但是在這類細(xì)胞中Nras G12D表達(dá)卻不能影響增殖。而在黑色素細(xì)胞中只有表達(dá)Nras Q61R而非Nras G12D才能誘導(dǎo)黑色素瘤發(fā)生。所以如果采取針對(duì)RAS突變的治療必須考慮到不同的家族成員和特定的密碼子突變。
KRAS基因編碼了2種不同的剪接變體：KRAS4A和KRAS4B，采用了不同外顯子4。其中KRAS4A在C端著額外的22-33氨基酸序列，因此有著不同的翻譯后修飾和膜定位；而KRAS4B被認(rèn)為是主要形式，因此在腫瘤細(xì)胞中普遍的高表達(dá)。近來發(fā)現(xiàn)KRAS4A也在腫瘤細(xì)胞株中廣泛表達(dá)，而且在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平與KRAS4B接近。KRAS4A在GEMMs中并不重要，敲除外顯子4A后胚胎已經(jīng)可存活——但敲除整個(gè)Kras卻能因此胚胎致死。近來發(fā)現(xiàn)Kras4B基因在小鼠中也是不重要，提示這兩種變體在發(fā)育中可能是功能冗余。但是敲除掉Kras4A和Kras4B中任意一個(gè)都能引起對(duì)肺腫瘤轉(zhuǎn)化的抵抗，提示兩種變體對(duì)腫瘤發(fā)生來說缺一不可，它們?cè)谀[瘤微環(huán)境中也有著特定的功能——KRAS4A的表達(dá)提升了對(duì)缺氧等壓力的適應(yīng)；而KRAS4B更多的在干細(xì)胞及祖細(xì)胞中表達(dá)。腫瘤在壓力下可以通過剪接表達(dá)KRAS4A來適應(yīng)，這些近來的研究更新了KRAS4A在腫瘤發(fā)生中的角色，同時(shí)由于要考慮KRAS4A也會(huì)改變KRAS抑制的視角。
2 RAS突變的生化特征
像RAS這樣的小GTPase蛋白在結(jié)合GDP的非活化態(tài)與結(jié)合GTP的活化態(tài)之間轉(zhuǎn)化。SOS這樣的鳥苷酸交換因子（GRE）或是鳥苷酸釋放蛋白能夠促進(jìn)將GDP替換為GTP；而像NF1及p20GAP這樣的GTPsae活化蛋白（GAP）則通過刺激GTP水解使得RAS回到結(jié)合GTP的非活化形式。RAS密碼子12、13級(jí)61位的突變會(huì)破壞GAP介導(dǎo)的GTP水解，使得這些突變體都聚積在結(jié)合GTP的活化狀態(tài)，從而進(jìn)一步激活下游的MAK或PI3K在內(nèi)的多條效應(yīng)通路促進(jìn)細(xì)胞的增殖。
內(nèi)源性的GTPase或許和GDP-GTP交換速率在不同的RAS突變體之間差異很大，這也為針對(duì)各個(gè)突變尋找最佳的靶向策略提供支持。例如，密碼子12、13和61的突變通常降低了內(nèi)源的GTPase活性，KRAS-G12C雖然例外，呈現(xiàn)了近乎野生型的內(nèi)源GTPase活性，但是降低了p12-GAP介導(dǎo)的水解速率。因此Shokat和他的同事基于KRAS-G12C這個(gè)獨(dú)特的生化特征來設(shè)計(jì)共價(jià)抑制劑來靶向結(jié)合GDP的KRAS。相反，KRAS G13D相比野生型有著明顯升高的交換速率，也就意味著結(jié)合GDP的時(shí)間很短。所以某種程度上KRAS中13位密碼子突變對(duì)NF1介導(dǎo)的水解更敏感，而12或61位密碼子的突變相對(duì)不敏感。更有意思的KRAS第13位密碼子突變常伴隨著NF1的突變，進(jìn)一步證明腫瘤有著克服KRAS G13和NF1活性的進(jìn)化選擇壓來保持著更高的生化活性。不同突變的生化性質(zhì)差異決定了那種核苷酸結(jié)合狀態(tài)更適合拿來設(shè)計(jì)等位特異性抑制劑，而低GTPase活性以及高的鳥苷酸交換將回來靶向結(jié)合GDP的形式帶來困難。
3 直接靶向RAS的方法
直接抑制RAS是治療RAS突變的腫瘤的理想策略，這里我們重點(diǎn)介紹了近期的一些進(jìn)展，包括switch-II突變選擇性的共價(jià)抑制劑和pan-RAS抑制劑的開發(fā)。
3.1 靶向KRAS-G12C的共價(jià)抑制劑
Kras基因?qū)τ谛∈蟀l(fā)育十分關(guān)鍵，而Nras及Hras并不是必需。如果人中對(duì)KRAS的需求也是類似，那么靶向野生型KRAS蛋白就會(huì)引發(fā)毒性的擔(dān)心。但是當(dāng)Kras替換成Hras后，小鼠也是可以存活的，這也在某種程度上降低毒性的擔(dān)心。成年小鼠中條件性敲除Kras后直接解釋這些擔(dān)心，但是目前這類研究尚未發(fā)表。這個(gè)領(lǐng)域的RAS抑制劑的開發(fā)主要有Shokat及其同事引導(dǎo)，主要集中在KRAS-G12C的共價(jià)抑制劑開發(fā)上，期望可以比變抑制全部的RAS異構(gòu)體引發(fā)的毒性。
KRAS-G12C上突變的12位密碼子——半胱氨酸（Cys）本身固有的反應(yīng)特點(diǎn)可以拿來研發(fā)共價(jià)結(jié)合的小分子抑制劑。共價(jià)靶向活性位點(diǎn)的半胱氨酸也是藥物發(fā)現(xiàn)中常采用的策略。更重要的是，野生型KRA
Shokat最早在KRAS-G12C中鑒定出switch-II后面的一個(gè)全新的別構(gòu)結(jié)合口袋，即switch-II口袋，并開發(fā)出一系列不可逆的的結(jié)合KRAS G12C的化合物。這些化合物結(jié)合KRAS-G12C結(jié)合GDP的形式，并且組算了SOS催化的核苷酸交換并阻斷了KRAS-G12C與下游RAF的結(jié)合。需要指出的是，這些化合物只結(jié)合KRAS-G12C結(jié)合GDP的狀態(tài)，因此需要KRAS-G12C陷阱里GTP的水解。穩(wěn)態(tài)下75%的KRAS G12C處于結(jié)合GTP的狀態(tài)（破壞了GAP水解），但是KRAS-G12C在諸多突變中有著最高的內(nèi)生GTPase活性，因此最易收到共價(jià)化合物的結(jié)合。由于KRAS中除了G12C以外的突變內(nèi)源GTP水解速率耕地，所以尚不清楚其他的突變類型中采用同樣的靶向switch-II口袋的策略是否也可以成功。
多家公司也在開發(fā)針對(duì)KRAS G12C的更強(qiáng)效的抑制劑，其中幾個(gè)已經(jīng)處于臨床——盡管發(fā)表的數(shù)據(jù)很少。AMG510是首個(gè)進(jìn)入臨床的該類分子，初步的1期結(jié)果還是比較振奮(NCT03600883)：特別在NSCLC中，13例患者接受了960mg QD的治療后，7例獲得PR，6例獲得SD；而在CRC中的結(jié)果則不那么顯著，12例患者中只有1例PR及10例SD。所幸的是，該研究34例患者沒有報(bào)道DLT或是導(dǎo)致治療終止的AE。而在臨床前模型中，AMG510可以專門只強(qiáng)效的抑制KRAS G12C細(xì)胞株的生長（IC50 6-9nM），并在移植模型中引起腫瘤退化。當(dāng)AMG510與激活RAS或RAS激活的蛋白（如EGFR、SHP2或MEK、AKT、PI3K）的抑制劑或是免疫治療聯(lián)合后，有著明顯協(xié)同增強(qiáng)的抑制效應(yīng)。
MRTX849同樣也處于臨床I/II期(NCT03785249)，早期研究中，患者接受600mg BID治療后，5例NSCLC患者中2例報(bào)道PR，而2例NSCLC患者中1例報(bào)道PR。而在臨床前模型中，MRTX849也能專門只強(qiáng)效的抑制KRAS G12C細(xì)胞株的生長（IC50 94-107nM）并在移植模型中引起腫瘤退化。當(dāng)與EGFR、SHP2、mTOR及CDK4/6抑制劑聯(lián)合后，MRTX849也呈現(xiàn)出協(xié)同增效的結(jié)果——甚至在MRTX849難治的腫瘤中也是如此。在一項(xiàng)CRISPR篩選中，敲除了NRAS或KEAP1引起了對(duì)MRTX849的抵抗，而敲除SHP2、MYC2或mTOR通路的基因則會(huì)增強(qiáng)對(duì)MRTX849的敏感性。
第三個(gè)KRAS G12C的共價(jià)抑制劑JNJ-74699157(ARS-3258)目前也處于臨床1期(NCT04006301)，結(jié)果還未發(fā)表。但是兩個(gè)前化合物ARS-853和ARS-1620可以特異的在攜帶KRAS G12C突變的腫瘤細(xì)胞株中減弱細(xì)胞增長并抑制下游MAPK信號(hào)同路。第四個(gè)KRAS G12C共價(jià)抑制劑LY3499446也處在臨床I/II期(NCT04165031) ：包括單藥及聯(lián)合了CDK4/6、EGFR或化療(多西他賽)的聯(lián)合方案，結(jié)果尚未發(fā)表。
上面討論的這類共價(jià)抑制劑需要KRAS G12C處于結(jié)合GDP的形式，但是會(huì)出現(xiàn)耐藥突變來促進(jìn)從GDP到GTP的交換，通過CRISPR篩選，鑒定出可能的突變機(jī)制包括NF1或是其他RAS異構(gòu)體(NRAS 或 HRAS)的缺失。
近來發(fā)現(xiàn)一些新的分子可以靶向GDP結(jié)合狀態(tài)和結(jié)合GTP結(jié)合狀態(tài)的KRAS。這些分子通常結(jié)合switch-II口袋附近但是遠(yuǎn)離核苷酸結(jié)合口袋的新的溝(switch-II groove)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)指出了switch-II口袋動(dòng)態(tài)變化的重要性，同時(shí)也為抑制劑可同時(shí)靶向兩種核苷酸結(jié)合態(tài)的RAS提供了概念驗(yàn)證的證據(jù)。
3.2 其他突變特異性的靶向策略
如上所述，KRAS G12C只占了KRAS突變的一小部分，而且主要還是在肺腺癌中。為了有效的抑制G12D和G12V在內(nèi)的其他常見的KRAS突變，針對(duì)這種缺少活性半胱氨酸的突變也需要不同的策略。由于不同的突變之間處于不同核苷酸結(jié)合狀態(tài)的比例不同，因此設(shè)計(jì)開發(fā)突變特異性抑制劑的時(shí)候需要考慮到生化性質(zhì)的差異并評(píng)估靶向哪種狀態(tài)（結(jié)合GDP or GTP）。
Revilution Medicine開發(fā)了RAS(ON)的三元復(fù)合物平臺(tái)：一個(gè)化合物可以介導(dǎo)包括KRAS G12C在內(nèi)的多個(gè)KRAS突變體與分子伴侶親環(huán)素A(cyclophilin A)的非天然的蛋白-蛋白相互作用，這類復(fù)合物的形成可以阻斷KRAS突變體結(jié)合SOS和能結(jié)合RAS的下游效應(yīng)蛋白。更有意思的是，這些分子(RM-007和RM-008)可以共價(jià)結(jié)合GTP結(jié)合態(tài)的G12C和G13C，并且有著抗細(xì)胞增殖的活性。由于靶向GTP結(jié)合態(tài)的分子可以破環(huán)經(jīng)典的GTP構(gòu)象并阻斷效應(yīng)蛋白的相互作用，因此這樣的策略可以克服可能的針對(duì)KRAS-G12C GDP結(jié)合態(tài)抑制劑的耐藥。
3.3 RAS效應(yīng)蛋白相互作用抑制劑
盡管KRAS G12C抑制劑對(duì)于靶向突變特異的狀態(tài)來說是有效的，但是要針對(duì)每個(gè)突變的RAS蛋白來篩選有效的治療又顯得繁瑣。直接靶向所有種類的RAS蛋白(KRAS4A、KRAS4B、NRAS 和 HRAS)中保守的配體結(jié)合位點(diǎn)可能給抑制跨癌種和覆蓋各個(gè)突變類型的RAS提供了一種策略。其中的一個(gè)化合物3314，結(jié)合到switch-I中保守的Asp38，阻斷了與效應(yīng)蛋白的結(jié)合?；衔?144能在體外結(jié)合野生型的KRAS、NRAS和HRAS，也能在體內(nèi)一直KRAS G13D突變腫瘤的生長，但是同樣也報(bào)道了毒性和脫靶活性。事實(shí)上由于RAS對(duì)于正常細(xì)胞信號(hào)來說十分關(guān)鍵，pan-RAS抑制劑不太可能有好的可耐受性。敲除所有的三個(gè)RAS異構(gòu)體引起小鼠模型中的胚胎致死，在體外試驗(yàn)中也觀察到細(xì)胞增殖信號(hào)的消失。
一個(gè)結(jié)合早期RAS的小分子DCAI，能夠微弱的抑制SOS1介導(dǎo)的核苷酸的交換，與KRAS的共結(jié)晶顯示DCAI結(jié)合在第2個(gè)α螺旋和核心的第1-3個(gè)β折疊之間的口袋里——稱作DCAI口袋，從而阻斷了KRAS和SOS1的結(jié)合。因?yàn)榻Y(jié)合到DCAI口袋的小分子可以阻止SOS1介導(dǎo)的鳥苷酸交換，因此RAS蛋白無法變成結(jié)合GTP的活化態(tài)，，使得這個(gè)口袋成為有希望的藥物靶點(diǎn)。
兩個(gè)化合物，Acd-和Ch-，可以可逆的結(jié)合到RAS的DCAi口袋，抑制劑CRAF、RalGDS及PI3K中具有催化活性的p110α、p110γ亞基與突變型KRAS、NRAS及HRAS的結(jié)合。第三個(gè)化合物BI-2852也結(jié)合到DCAI口袋，下調(diào)了SOS1介導(dǎo)的交換，從而降低了下游激酶ERK和AKT的磷酸化。
DCAI口袋同樣存在于RAS蛋白，因此這些化合物可以作為pan-RAS抑制劑發(fā)揮功能，因此并沒有突變選擇性。由于pan-RAS抑制劑的毒性問題，后續(xù)需要進(jìn)一步對(duì)突變的選擇性進(jìn)行優(yōu)化。
4 非直接靶向RAS的策略
正常的RAS活化需要核苷酸交換、處理、膜定位和效應(yīng)蛋白結(jié)合，改變其中任意的關(guān)鍵步驟可以用來間接的抑制RAS的活化。
4.1 核苷酸交換循環(huán)抑制劑
4.1.1 SOS1抑制劑
最初尋找阻斷GEF對(duì)RAS的活性篩出了一個(gè)結(jié)合KRAS的位點(diǎn)在switch-I和switch-II之間小分子，Kd值大約190μM，因此可以抑制SOS1的結(jié)合及SOS1介導(dǎo)的核苷酸交換。后續(xù)嘗試用一段模擬正構(gòu)SOS1螺旋的分子來抑制SOS1-RAS的相互作用。盡管這個(gè)分子可以納摩爾級(jí)的親和力結(jié)合SOS1，但是細(xì)胞活性很低。隨后這個(gè)領(lǐng)域轉(zhuǎn)向?qū)ふ襍OS1的小分子抑制劑，隨后3個(gè)團(tuán)隊(duì)篩到了結(jié)合到SOS1中CDC25結(jié)構(gòu)域以及RAS-SOS1-RAS三原復(fù)合物中RAS的switch-II附近的小分子。有意思的是，這些小分子的結(jié)合可以活化或抑制SOS1-RAS的相互作用。其中一個(gè)研究組篩出了小分子抑制劑BAY-293，能夠在納摩爾水平抑制SOS1-KRAS的相互作用，但是抑制KRAS突變的細(xì)胞增殖效應(yīng)較弱(IC50=3μM)，而抑制KRAS野生型細(xì)胞的效應(yīng)較強(qiáng)(IC50=1μM)。BAY-293與KRAS G12C共價(jià)抑制劑ARS-853在KRAS-G12C突變的細(xì)胞株中顯示了協(xié)同的生長抑制效應(yīng)，提示SOS1抑制劑可以和結(jié)合GDP的KRAS-G12C抑制劑聯(lián)合——SOS1抑制可以增加非活化態(tài)的KRAS-G12C水平?，F(xiàn)在SOS1抑制劑BI01701963的單藥及聯(lián)合MEK抑制劑曲美替尼的1期臨床正在進(jìn)行中(NCT04111458)。
4.1.2 SHP2抑制劑
SHP2是一個(gè)非受體的蛋白酪氨酸磷酸酶，對(duì)于MAPK通路的完全活化是必需的。編碼SHP2的PTPN11基因的突變能夠引起RASopathies，并存在于在50%的Noonan綜合癥患者中。雖然SHP2的功能還存在未知的地方，但現(xiàn)在的模型中SHP2作為一個(gè)骨架蛋白，結(jié)合到GRB2和SOS1，從而促進(jìn)核苷酸的交換。SHP2的抑制可能和SOS1抑制劑功能類似，阻斷了野生型KRAS加載GTP。KRAS突變的腫瘤對(duì)SHP2有依賴：腫瘤模型中敲除Ptpn11可以延緩腫瘤的增長，但是不能引起消退。
通過化合物文庫篩選得到的SHP-099可以將SHP2鎖定在自我抑制的構(gòu)象，能夠強(qiáng)效的別構(gòu)抑制SHP2(
IC50=0.071μM)。在KRAS G12D突變的PDAC及NSCLC的PDX模型中，SHP-099與MEK抑制劑曲美替尼聯(lián)合后能夠協(xié)同性的抑制細(xì)胞增殖，但是在KRAS G13D的細(xì)胞株對(duì)SHP-099并不敏感。
RMC-4550是一個(gè)強(qiáng)效的、選擇性SHP2別構(gòu)抑制劑，結(jié)合位點(diǎn)與SHP-099相同并能穩(wěn)定在SHP2的自抑制構(gòu)象。RMC-4550處理后可以降低細(xì)胞增殖，但這種效應(yīng)只在12位密碼子突變的細(xì)胞中比較明顯，而13或61位密碼子突變的細(xì)胞中并沒觀察到。KRAS G12C突變的細(xì)胞中觀察到的敏感性最強(qiáng)，而G12D、G12V突變中觀察到的敏感性比較弱。這些發(fā)現(xiàn)也強(qiáng)調(diào)了各個(gè)突變的生化性質(zhì)決定了依賴于RAS活性的鳥苷酸交換，內(nèi)源性或GAP介導(dǎo)的GTP水解升高的突變某種程度上對(duì)SHP2抑制更敏感。
衍生自RMC-4520的臨床候選藥物RMC-4630目前啟動(dòng)了單藥的臨床I期(NCT03634982)和聯(lián)合MEK抑制劑Cobimetinib的Ib/II期臨床(NCT03989115)。另一個(gè)SHP2異構(gòu)抑制劑JAB-3068也處于臨床I/II期，但尚無結(jié)果發(fā)表(NCT03518554, NCT03565003)。 第三個(gè)SHP2抑制劑TNO-155也啟動(dòng)了單藥的臨床I期(NCT03114319)和聯(lián)合MRTX-849的臨床I/II期(NCT04330664)。這些研究都尚無結(jié)果發(fā)表。
4.2 RAS加工抑制劑
RAS只有定位到細(xì)胞膜才有活性。要結(jié)合到細(xì)胞膜，RAS需要3個(gè)翻譯后酶催化的加工步驟：1）法尼基轉(zhuǎn)移酶(FTase)或香葉襲氨基轉(zhuǎn)移酶(GGTase)催化CAAX box的異戊烯化；2）RAS轉(zhuǎn)化酶(RCE1)切除末端的AAX殘基；3）異腎素半胱氨酸羧基甲基轉(zhuǎn)移酶(ICMT)催化了CAAX box中半胱氨酸的甲基化。因此抑制RAS的加工可以阻止結(jié)合細(xì)胞膜和下游RAS信號(hào)。
盡管FTase抑制劑(FTI)臨床上在KRAS突變的腫瘤中結(jié)果讓人失望，可能因?yàn)镕Tase和GGTase間的功能冗余，但是臨床上重新關(guān)注FTI在HRAS突變的腫瘤中的使用。與KRAS及NRAS 不同，HRAS專門由FTase異戊烯化，因此FTI處理HRAS突變的腫瘤是有用的。事實(shí)上，也在攜帶HRAS突變的HSNCC和NSCLC的PDX中觀察到對(duì)FTI tipifarnib的應(yīng)答。Tipifarnib目前正在開展針對(duì)HRAS突變的HNSCC和甲狀腺癌的II期臨床(NCT02383927)。已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果中，6例接受Tipifarnib治療的患者中4例PR，2例SD。
在KRAS及NRAS突變的腫瘤中避免GGTase對(duì)FTase的補(bǔ)償作用的一個(gè)策略就是同事靶向下游的RAS加工酶RCE1和ICMT，這兩個(gè)酶在KRAS突變而非KRAS野生型的細(xì)胞中十分關(guān)鍵。相反，F(xiàn)Tase的β亞基不管在KRAS野生型還是突變的細(xì)胞中都很關(guān)鍵，因此酶活完全活性就會(huì)在所有的細(xì)胞中引起致死。因此抑制劑RCE1或ICMT可能會(huì)提供突變選擇性并降低FTI的毒性。
ICMT的小分子抑制劑cysmethynil(IC50=2.4 μM)破壞了RAS結(jié)合到膜，能夠體外(EC50=20μM)及體內(nèi)降低RAS突變的細(xì)胞株的生長。進(jìn)一步修改cysmethynil后可以提升抑制ICMT的效果但是卻變得不能抑制細(xì)胞生長。迄今為止最強(qiáng)效的ICMT抑制劑(IC50=1.3μM)只能輕微的降低細(xì)胞增殖(EC50=0.3-10+μM)。近來發(fā)現(xiàn)的UCM-1336(IC50=2μM)可以破壞全部4種RAS異構(gòu)體結(jié)合到細(xì)胞膜，同樣也能在體外(EC50=2-12μM)及體內(nèi)抑制RAS突變的細(xì)胞的增殖。UCM-1336在結(jié)構(gòu)上與衍生自cysmethynil的化合物完全不同，但仍需要進(jìn)一步優(yōu)化以增強(qiáng)療效。目前尚未鑒定出強(qiáng)效的、選擇性的RCE1抑制劑。
經(jīng)歷翻譯后修飾的RAS定位和運(yùn)輸由結(jié)合到法尼基化的RAS的異戊二烯基結(jié)合蛋白的磷酸二酯酶δ(PDEδ)調(diào)控。小分子Deltarasin結(jié)合到PDEδ的法尼基結(jié)合口袋，阻止了KRAS的結(jié)合(Kd=7.6 nM)，產(chǎn)生了KRAS的錯(cuò)位分布，最終降低了細(xì)胞增殖。隨后計(jì)算機(jī)Docking篩到另一個(gè)化合物NHTD，阻止了KRAS結(jié)合到PDEδ。NHTD可以在體外和體內(nèi)抑制KRAS突變的腫瘤細(xì)胞的生長(EC50=2-7μM)，但是并沒有Deltarasin相關(guān)的毒性事件。
需要指出的是，討論的這些酶同樣加工其他結(jié)合細(xì)胞膜的蛋白，可能會(huì)引起脫靶效應(yīng)，因此直接抑制劑RAS可能是現(xiàn)在最強(qiáng)的治療策略。
4.3 RAS寡聚和效應(yīng)子結(jié)合
一經(jīng)有效加工，RAS蛋白就定位到細(xì)胞膜并形成寡聚或二聚體——這對(duì)RAS驅(qū)動(dòng)的信號(hào)來說是必需的。RAS蛋白被發(fā)現(xiàn)可以按異構(gòu)體特異的形式組裝成5-9個(gè)蛋白形成的納米簇，對(duì)于下游信號(hào)的激活非常關(guān)鍵。近來RAS的二聚化成為了RAS自結(jié)合來增加骨架形成和信號(hào)活性的另一類機(jī)制。
很難在體外構(gòu)建RAS二聚體或寡聚體特別是用翻譯后修飾的RAS和脂膜或Nanodiscs(納米磷脂盤)重新構(gòu)建。由于缺少最終的結(jié)構(gòu)與生化數(shù)據(jù)，大部分致力于RAS-RAS相互作用的分子界面的研究局限于計(jì)算建模和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同樣也包括借助PDB數(shù)據(jù)庫里數(shù)以百計(jì)的RAS的晶體堆積作用。盡管鑒定出并驗(yàn)證了多個(gè)界面，很多計(jì)算和實(shí)驗(yàn)的研究都聚焦于RAS二聚化中的單個(gè)界面，也就是第4和5個(gè)α螺旋形成的界面(α4–α5)，這同樣也是很多HRAS、KRAS和NRAS結(jié)構(gòu)中最主要的一個(gè)晶體堆積作用。
納米抗體NS1可以靶向上文提到的α4–α5界面，通過直接結(jié)合到這個(gè)界面來破壞HRAS(Kd=13nM)和KRAS(Kd=65nM)的自結(jié)合，能在不干擾RAS定位和GTPase活性的情況下減弱下游信號(hào)的活化并抑制了細(xì)胞增殖。后續(xù)需要進(jìn)一步的鑒定和驗(yàn)證這些RAS-RAS相互作用界面，因?yàn)楹髞硪豁?xiàng)研究證明經(jīng)過完全加工的KRAS在一連串的濃度范圍內(nèi)能已單體形式存在于脂膜。
最近發(fā)現(xiàn)的RAS自動(dòng)抑制新機(jī)制：膜閉塞，為靶向RAS蛋白-蛋白互作提供了另一種潛在途徑。在膜閉塞中，RAS與脂膜直接作用后將RAS的效應(yīng)蛋白結(jié)合界面從細(xì)胞質(zhì)中分離出來。一個(gè)小分子Cmpd2可以結(jié)合到RAS和脂膜間的界面(Kd=1μM)，促進(jìn)膜阻塞并減少了結(jié)合到RAF的RBD結(jié)構(gòu)域。由于RAS-效應(yīng)蛋白界面高度保守性，這類策略為有效抑制RAS驅(qū)動(dòng)的所有下游信號(hào)通路提供了機(jī)會(huì)。
4.4 靶向RAS信號(hào)通路
靶向RAS通路有兩種的不同方法：鑒定RAS突變后合成致死的基因；靶向酪氨酸激酶受體(如EGFR家族）和RAS效應(yīng)通路，即MAPK和PI3K。
4.4.1 合成致死篩選
在KRAS和NRAS突變的細(xì)胞株中，除了RAS本身，最重要的必需基因是RAF1(編碼CRAF)和SHOC2。另一項(xiàng)研究證實(shí)RAS突變的人AML細(xì)胞株需要RAF1和SHOC2。
在Kras G12V的小鼠肺腺癌模型中破壞Craf能顯著引起腫瘤體積縮小，同時(shí)也并沒有發(fā)現(xiàn)CRAF缺失引起任何系統(tǒng)性不良事件，也沒有改變MAPK信號(hào)，提示CRAF可能以這種不依賴激酶的形式發(fā)揮功能。后續(xù)研究在Kras G12V的小鼠PDAC模型中同時(shí)破壞Egfr和Craf能引起腫瘤的完全消退，而2個(gè)基因同時(shí)破壞后的耐受性也很好。第二個(gè)研究用了在PDAC的PDX模型同時(shí)敲除EGFR和CRAF的表達(dá)同樣也能減緩腫瘤。這些發(fā)現(xiàn)指出了抑制CRAF在治療上的優(yōu)勢(shì)，提示了需要靶向CRAF的選擇性的抑制劑，但是由于RAF家族激酶結(jié)構(gòu)域間高度同源以及CRAF可能以不依賴激酶的形式發(fā)揮作用，因此需要新的技術(shù)方法來。
由SHOC2、MRAS和蛋白磷酸酶1(PP1)組成的磷酸酶復(fù)合體催化了RAF上Ser259的去磷酸化，這個(gè)去磷酸化可以減輕14-3-3對(duì)RAF的負(fù)調(diào)控并促進(jìn)RAF的二聚化。因此SHOC2促進(jìn)了RAF的二聚化，更重要的是SHOC2對(duì)于最大化ERK的活性是必需的。在Kras G12D的小鼠肺腺癌模型中破壞Shoc2能不引起毒性的同時(shí)降低腫瘤負(fù)荷、延長生存期。而在EGFR與KRAS雙突變的NSCLC細(xì)胞中敲除SHOC2能夠減少種植模型的生長，同時(shí)引起歲MEK抑制的敏感性(包括selumetinib、曲美替尼、PD0325901 和 pimasertib)。CRISPR-Cas9篩選確定SHOC2缺失的同時(shí)用曲美替尼處理會(huì)導(dǎo)致合成致死。這些發(fā)現(xiàn)提示，SHOC2抑制劑不僅可以作為單一藥物提供治療獲益，還有與MEK抑制劑聯(lián)用的潛力。
4.4.2 EGFR家族療法
有證據(jù)顯示RAS與受體酪氨酸激酶中的EGFR家族存在相互作用。EGFR家族位于RAS上游，因此這些RTK失活可以減少RAS的激活。研究主要集中在EGFR的抑制，特別是治療RAS突變的腫瘤。
靶向EGFR的西妥昔單抗和帕尼單抗都能延長KRAS等位基因野生型——同樣也需要NRAS、BRAF和PIK3CA無突變的晚期CRC的OS和PFS，但是這些單抗在KRAS突變尤其是密碼子12和13突變的腫瘤中無效，所以西妥昔單抗和帕尼單抗都只獲批治療KRAS未突變的晚期CRC。另外獲批治療EGFRm NSCLC的厄洛替尼和吉非替尼單藥治療KRAS突變的NSCLC也無效。
一項(xiàng)這對(duì)西妥昔單抗和帕尼單抗治療晚期CRC臨床的回顧性研究中，分析了各個(gè)突變類型的臨床獲益。攜帶KRAS G13D突變的患者接受西妥昔單抗治療后比KRAS其他突變有著更長的OS和PFS。另一項(xiàng)帕尼單抗的回顧性分析中，KRAS G13D突變的患者似乎不能從治療中獲益。一項(xiàng)代號(hào)ICECREAM的臨床2期正在進(jìn)行中，只在評(píng)估西妥昔單抗治療KRAS G13D突變的晚期CRC的療效(ACTRN12612000901808)。
盡管KRAS野生型的CRC會(huì)對(duì)西妥昔單抗應(yīng)答，但最終晚期CRC也會(huì)對(duì)anti-EGFR治療難治，獲得性的KRAS突變就是耐藥機(jī)制之一，這些突變包括KRAS擴(kuò)增和體系突變(最常見的是G13D)，但是不清楚這些突變是是在西妥昔單抗治療前就存在還是治療的結(jié)果。
敲除Egfr可以在遺傳小鼠模型中抑制KRAS G12D突變的PDAC和NSCLC腫瘤。在KRAS G12D或?qū)Χ蚵逄婺崮退幍哪[瘤的早期事件都包括EGFR在內(nèi)的整個(gè)EGFR家族的表達(dá)上調(diào)，如ERBB2、ERBB3和ERBB4。EGFR突變或EGFR、HER2、HER3或HER4擴(kuò)增的NSLCC患者的生存都很差。用FDA批準(zhǔn)的pan-ERBB抑制劑阿法替尼或來那替尼治療原發(fā)的KRAS G12D腫瘤，相比吉非替尼和厄洛替尼可以顯著縮小腫瘤體積?，F(xiàn)在正在開展評(píng)估來那替尼單藥及聯(lián)合HDAC抑制劑divalproex治療RAS突變的實(shí)體瘤的I/II期臨床(NCT03919292)。
pan-ERBB或EGFR抑制劑聯(lián)合MEK或KEAS G12C共價(jià)抑制劑可以帶來驚喜。阿法替尼抑制ERBB3后使得KRAS突變的CRC和NSCLC細(xì)胞對(duì) selumetinib的MEK抑制敏感。阿法替尼或來那替尼聯(lián)合MEK抑制劑去曲美替尼延長了KRAS G12D NSCLC小鼠的生存期，由于動(dòng)物模型是治療一周后監(jiān)測(cè)生存期，提示聯(lián)合方案帶來了持續(xù)的緩解。ARS-853聯(lián)合吉非替尼或厄洛替尼處理KRAS G12C細(xì)胞有顯著的協(xié)同效應(yīng)，厄洛替尼也降低了KRAS G12C結(jié)合GTP的比例。由于ARS 853和其他類型的KRAS G12C共價(jià)抑制劑可以結(jié)合到GDP結(jié)合態(tài)的KRAS G12C，EGFR TKI的療效則提示：EGFR可以活化突變的RAS而抑制后降低了GTP結(jié)合態(tài)的KRAS G12C的量，提升了療效。
4.4.3 MAPK通路-RAF抑制劑
結(jié)合GTP的RAS活化態(tài)促進(jìn)RAF二聚化和磷酸化，從而誘導(dǎo)RAF激酶活性并導(dǎo)致RAF底物MEK1和MEK2磷酸化。磷酸化級(jí)聯(lián)伴隨著MEK磷酸化下游的ERK1和ERK2而繼續(xù)。ERK激酶活性既激活包括ETS家族在內(nèi)的促進(jìn)生長的轉(zhuǎn)錄因子，又參與負(fù)反饋回路，此動(dòng)態(tài)過程保證了MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)的持續(xù)和強(qiáng)度。ERK可通過磷酸化上游SOS或CRAF，或是改變雙特異性磷酸酶(DUSP)家和Sprouty(SPRY)家族的轉(zhuǎn)錄來抑制MAPK信號(hào)傳導(dǎo)。DUSPs通過隔離SOS-GRB2來使ERK和SPRYs去磷酸化，從而抑制RTKs信號(hào)傳導(dǎo)。為了有效治療RAS突變腫瘤，必須完全抑制MAPK通路，一種策略是用針對(duì)MAPK通路組成的激酶抑制劑，并聯(lián)合本綜述討論的針對(duì)其他機(jī)制的療法。
現(xiàn)在BRAF V600和MEK抑制劑已經(jīng)獲批針對(duì)BRAF V600突變的腫瘤但是并未獲批治療RAS突變的腫瘤。臨床上獲批的BRAF V600抑制劑vemurafenib和dabrafenib可以誘導(dǎo)RAF激酶結(jié)構(gòu)域中αC螺旋的外移，這些抑制劑可有效的抑制RAF單體(BRAF V600以單體傳導(dǎo)信號(hào))但不能用于RAS突變腫瘤，因?yàn)槠渲行盘?hào)通過BRAF-CRAF二聚體傳導(dǎo)。更反常的是，在RAS突變的腫瘤中，這些抑制劑可以結(jié)合野生型RAF誘導(dǎo)二聚化和下游MEK及ERK的磷酸化來激活MAPK信號(hào)。這種反常激活依賴于抑制劑的結(jié)合模式：而RAF二聚體抑制劑引起的激活遠(yuǎn)低于已經(jīng)獲批的那些BRAF V600抑制劑。
RAF二聚體抑制劑，如AZ-628、belvarafenib、LY3009120和 LXH-254結(jié)合到RAF后DFG模體在外而αC螺旋在內(nèi)，可以有效的針對(duì)單體和二聚體：盡管依舊會(huì)促進(jìn)二聚化，但是可以結(jié)合二聚體組分，因此這種反常的激活較少見。其中很多抑制劑都是pan-RAF抑制劑，在RAS突變和BRAF突變的腫瘤中都有活性。評(píng)估LY3009120的臨床1期由于缺少臨床獲益而終止(只有15%的SD)。
現(xiàn)在，兩個(gè)pan-RAF抑制劑治療RAS突變的腫瘤處于臨床1期：belvarafenib(NCT02405065, NCT03118817)和LXH-254(NCT02607813)。belvarafenib在特定的BRAF突變和NRAS突變的腫瘤中都有療效：在6例BRAF突變的黑色素瘤中1例獲得PR，在7例BRAF突變的CRC中2例獲得PR，而在9例NRAS突變的黑色素瘤中2例獲得PR.
4.4.4 MAPK通路：MEK抑制劑
目前有三種靶向MEK的別構(gòu)抑制劑——Cobimetinib、Trametinib曲美替尼和Binimetinib獲批用于治療BRAF V600突變的黑色素瘤，但是MEK抑制劑單藥治療RAS突變腫瘤沒有任何改善，因?yàn)槟壳耙矝]有一種MEK抑制劑獲批用于治療RAS突變腫瘤。MEK抑制劑和RAF抑制劑一樣，在RAS突變的腫瘤中都會(huì)誘導(dǎo)信號(hào)反饋回路，療效較弱。
盡管MEK抑制劑單藥在大部分RAS突變的腫瘤臨床中都失敗了，只有NRAS突變的黑色素瘤呈現(xiàn)一定的敏感性。例如，一項(xiàng)臨床2期顯示，20例NRAS突變的黑色素瘤患者接受binimetinib治療后20%的患者獲得了PR，基于此，一項(xiàng)對(duì)比binimetinib和達(dá)卡巴嗪治療NRAS Q61突變的黑色素瘤的的三期臨床正在進(jìn)行中(NCT01763164)。另一項(xiàng)2期臨床中，pimasertib相比達(dá)卡巴嗪改善了NRAS突變黑色素瘤的PFS(NCT01693068)，但是不能改善整體人群的OS，所以也沒獲得FDA批準(zhǔn)。相似的臨床中，MEK抑制劑和標(biāo)準(zhǔn)療法治療KRAS突變的PDAC、CRC和NSCLC時(shí)也未能帶來臨床獲益。在細(xì)胞水平上，NRAS突變的黑色素瘤細(xì)胞相比KRAS突變的細(xì)胞對(duì)pan-MEK抑制劑更加敏感。這種敏感性的差異需要進(jìn)一步探索是由黑色素瘤本身的特征、突變的NRAS還是61位密碼子突變的生化特征引起。
MEK和RAF抑制劑單藥治療RAS突變的腫瘤都無法提供臨床獲益，這類抑制劑現(xiàn)在都在進(jìn)行聯(lián)合治療的探索。由于MAPK通路中反饋環(huán)路的復(fù)雜性，靶向該通路中的多個(gè)節(jié)點(diǎn)會(huì)持續(xù)穩(wěn)定的抑制ERK磷酸化(通常是MAPK通路整體活性的測(cè)量指標(biāo))。事實(shí)也是如此，RAS突變腫瘤細(xì)胞中聯(lián)合抑制MEK和RAF后有協(xié)同效應(yīng)并阻斷了通路的再次激活。更重要的是，在MEK抑制后誘導(dǎo)的MEK磷酸化和RAS中GTP的加載都需要MEK和RAF聯(lián)合的協(xié)同效應(yīng)。在高內(nèi)源性核苷酸交換水平的KRAS突變(如KRAS-G13D)增強(qiáng)了GTP結(jié)合態(tài)的RAS水平，但觀察到了MEK和RAF的最強(qiáng)協(xié)同作用：MEK抑制可引起RAF二聚化，可能有助于這種協(xié)同作用。目前有兩項(xiàng)RAF抑制劑和MEK抑制劑聯(lián)用的I期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行。一個(gè)Belvarafenib和Cobimetinib的聯(lián)用(NCT03284502)，另一個(gè)是曲美替尼和LXH-254的聯(lián)用(NCT02974725)。
4.4.5 MAPK通路：ERK抑制劑
級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最終的激酶ERK被抑制后可以直接降低致癌轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并為對(duì)MEK或RAF抑制耐藥的腫瘤提供有價(jià)值的治療選擇。ERK抑制劑的臨床開發(fā)落后于MEK，BRAF單體和pan-RAF抑制劑的開發(fā)。此外，ERK抑制劑用于治療RAS突變腫瘤的早期臨床在很多都沒有成功。
臨床前候選藥物SCH-772984有著雙重的ERK抑制機(jī)制：一方面結(jié)合并抑制ERK1/2，另一方面誘導(dǎo)構(gòu)象遷移阻斷了上游激酶的磷酸化。SCH-772984處理RAS突變細(xì)胞降低了ERK磷酸化的水平和細(xì)胞增殖。臨床候選化合物MK-8353相比SCH-772984改善了PK，也是類似的雙重抑制劑，并能在NRAS突變的黑色素瘤模型中降低細(xì)胞增殖。但是在單藥治療的臨床I期中，26例KRAS或NRAS 突變的腫瘤患者接受治療后并沒有觀察到臨床緩解，而在BRAF V600突變的黑色素瘤轉(zhuǎn)折中觀察到了3例PR。目前MK-8353聯(lián)合selumetinib (NCT03745989)和K藥(NCT02972034)治療RAS突變腫瘤的臨床正在進(jìn)行中。
ERK抑制劑GDC-0944聯(lián)合cobimetinib在KRAS突變的腫瘤模型中展現(xiàn)了療效。盡管臨床前的移植模型中治療劑量會(huì)抑制腫瘤生長，但是cobimetinib聯(lián)合GDC-0944的臨床1期卻由于患者無法耐受聯(lián)合療法而終止。當(dāng)GDC-0944作為單藥評(píng)估時(shí)，臨床1期研究確定了RP2D為 400mg QD 用3周停1周可以耐受。在臨床中14例BRAF突變的CRC和胃癌患者接受治療后2例獲得PR，7例SD剩余5例PD。而在14例KRAS突變的腫瘤患者接受治療后只有4例SD，剩余10例PD。GDC-0944可以引起不同程度的MAPK通路抑制19-51%：相比KRAS突變的PDAC(1/4)，BRAF突變的CRC中的抑制強(qiáng)(3/4)。后續(xù)一項(xiàng)臨床II期在100mg QD的低劑量水平評(píng)估NRAS突變的腫瘤。
Ulixertinib(BVD-523)是一個(gè)選擇性、可逆的、ATP競爭結(jié)合的ERK1/2抑制劑。近期完成的一項(xiàng)1期臨床中，ulixertinib在NRAS突變的黑色素瘤和BRAF突變的實(shí)體瘤中顯示了抗腫瘤效應(yīng) 。在這項(xiàng)臨床中，17例NRAS突變的黑色素瘤患者接受治療后3例獲得PR，6例SD剩下9例PD，盡管NRAS突變的黑色素瘤的結(jié)果還是鼓舞人心的，但是KRAS突變的腫瘤中不如人意。之前NRAS突變的腫瘤對(duì)MEK和pan-RAF抑制劑的應(yīng)答也是比KRAS突變的腫瘤要好，所以KRAS突變的腫瘤還是需要進(jìn)一步的評(píng)估。目前Ulixertinib聯(lián)合化療(包括吉西他濱和白紫)治療晚期PDAC的I期臨床正在進(jìn)行中(NCT02608229)。
KO-947在臨床前模型中有效的降低ERK磷酸化水平，治療RAS突變及BRAF突變的NSCLC正處在臨床I期(NCT03051035)。體外實(shí)驗(yàn)中能觀察到持久穩(wěn)定的應(yīng)答：在單次劑量后ERK磷酸化水平抑制了5天，這些特點(diǎn)還是區(qū)別于其他的ERK抑制劑的，提示KO-947可能會(huì)有治療上的優(yōu)勢(shì)。不過要指出的是，這種持久穩(wěn)定的ERK磷酸化的抑制可能最終會(huì)引起患者的不耐受。
LY-3214996在體外也是一個(gè)對(duì)ERK1和ERK2強(qiáng)效的選擇性的抑制劑(IC50 = 5 nM)，目前也在臨床I期(NCT02857270)。在劑量爬坡組，33例RAS突變和16例BRAF突變的腫瘤患者接受了LY-3214996治療，7例BRAF突變的患者的腫瘤有了消退，2例SD，而RAS突變的患者中只有1例SD，其余全部PD。
總體而言，單藥MEK、RAF或ERK抑制劑治療RAS突變腫瘤幾乎沒有療效，因此必須聯(lián)合MAPK通路的其他抑制劑或其他療法。尋找最佳組合將是一個(gè)挑戰(zhàn)，但等位基因特異性RAS抑制劑的出現(xiàn)增加了可獲得信號(hào)通路最大抑制的潛在組合的數(shù)量。
4.4.6 PI3K通路抑制劑
MAPK通路一直是抑制RAS突變腫瘤的主要焦點(diǎn)，但RAS也激活了PI3K通路。PI3K大致分3類：I類PI3K被GTP結(jié)合態(tài)的RAS激活后，將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化成的磷脂酰肌醇-3,4,5-二磷酸(PIP3)，可以將AKT招募到細(xì)胞膜進(jìn)一步激活下游mTOR。I類PI3K是一個(gè)異二聚體，包括了催化亞基p110和調(diào)控亞基p85?；?em>PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG分別編碼了4個(gè)p110亞基異構(gòu)體：p110α、p110β、p110δ和p110γ。其中p110α和p110β表達(dá)廣泛，而p110δ和p110γ主要只表達(dá)于免疫細(xì)胞，另外p110β和p110γ既能被GPCR激活，也能被RTK激活。腫瘤通過PI3KCA突變、AKT擴(kuò)增或PTEN(編碼了將PIP3轉(zhuǎn)化為PIP2的磷酸酶)缺失來上調(diào)PI3K。現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)有趣的是，PI3K突變可以與RAS突變共存，但RAS突變通常與MAPK通路中EGFR和BRAF的突變相互排斥。這說明，RAS突變足夠使MAPK而非PI3K通路失調(diào)。PI3K通路的激活通常是在化療或MAPK通路抑制后，也就是對(duì)這兩類治療產(chǎn)生了抵抗。這提示MAPK和PI3K抑制的聯(lián)合治療在RAS突變的腫瘤中可能奏效。
區(qū)別于p110δ和p110γ，p110α不僅廣泛表達(dá)，而且可以被RAS專門激活，所以這里著重討論p110α抑制劑。目前有4種I類PI3K抑制劑獲得FDA批準(zhǔn)，其中alpelisib是p110α特異的抑制劑，另一個(gè)copanlisib則是pan- I類PI3K抑制劑，所有的都未批準(zhǔn)用于治療RAS突變腫瘤。
RAS激活PI3K和MAPK通路，并且存在重疊的反饋機(jī)制。抑制其中一條通路可導(dǎo)致另一條通路的代償性激活。因此同時(shí)抑制MAPK和PI3K值得注意。臨床前研究表明，PI3K和PI3K的聯(lián)合抑制對(duì)于RAS突變腫瘤是有效的，而且臨床上可實(shí)現(xiàn)。但是這些抑制劑聯(lián)合在臨床試驗(yàn)則顯示不耐受的，幾乎沒有療效，大概是由于毒性導(dǎo)致劑量下調(diào)。
為了克服這些毒性，研究聚焦于鑒定出可以使得PI3K、MAPK單個(gè)或同時(shí)被控制的RTK。其中一個(gè)例子就是胰島素樣因子1受體(IGF1R)被需要用與RAS介導(dǎo)的PI3K的激活。IGF1R和MEK的抑制劑在CRC和NSCLC的模型中有著協(xié)同效應(yīng)。此外，小鼠模型中用KRAS G12C共價(jià)抑制劑替換掉MEk抑制劑后與IGF1R抑制劑linsitinib聯(lián)合后，相比原先組合，能夠顯著提升療效并改善可耐受性，這種改善需要臨床評(píng)估。
目前還沒有AKT抑制劑獲批用于RAS突變的腫瘤，AKT和MEK抑制劑聯(lián)合治療正在進(jìn)行臨床，但是毒性與PI3K-MEK抑制的研究相似。mTOR抑制劑(everolimus依維莫司或temsirolimus) 聯(lián)合MEK抑制劑(trametinib 或pimasertib)的可耐受性極差。
未來需要研究來尋找最佳的組合方案，p110α特異性抑制劑需要有更少的脫靶效應(yīng)和更好的毒性譜。目前p110δ/p110γ抑制劑已經(jīng)獲批治療CLL和SLL，這兩個(gè)異構(gòu)體主要表達(dá)于白細(xì)胞，因此這些抑制劑治療RAS驅(qū)動(dòng)的白血病會(huì)很有效。因此針對(duì)PI3K的治療需要進(jìn)一步評(píng)估與綜述提及的其他療法聯(lián)用，例如包括KRAS G
12C在內(nèi)的等位基因特異性抑制劑。
5 新興療法
5.1 小干擾RNA療法 (siRNA療法)
小鼠模型中全身系統(tǒng)性輸送含有靶向KRAS的siRNA的納米顆?？赡苁且粋€(gè)針對(duì)KRAS這個(gè)靶點(diǎn)治療的有效方法而且可以做到突變特異。阿斯利康開發(fā)的一款代號(hào)AZD4785的化學(xué)修飾的反義寡核苷酸，在臨床前模型中經(jīng)皮下注射后可以顯著降低KRAS水平，但是臨床試驗(yàn)結(jié)果并不顯著(NCT03101839)。這方面需要改善藥物攝取和內(nèi)化并最終提升我們的認(rèn)知來改善療效。Silenseed公司對(duì)KRAS G12D突變特異的siRNA療法siG12D-LODER，在1期臨床試驗(yàn)中與化療聯(lián)用顯示出對(duì)PDAC的希望，12例患者2例PR、10例SD(NCT01188785)，而siG12D-LODER與吉西他濱+白紫聯(lián)用治療KRAS G12D的PDAC的2期臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中(NCT01676259)。
5.2 自吞噬 （注：這一段真是敗筆）
不管是siRNA或shRNA(短發(fā)夾RNA)對(duì)KRAS表達(dá)的抑制，還是KRAS G12C抑制劑(ARS-853, ARS-1620)、MEK抑制劑 (trametinib, cobimetinib) 或 ERK抑制劑 (SCH772984)對(duì)MAPK通路的抑制都會(huì)增加自吞噬。PDAC細(xì)胞自吞噬水平升高，這些細(xì)胞需要自吞噬才能維持生長，臨床前模型中通過藥物抑制或者敲除自吞噬相關(guān)基因后能誘導(dǎo)腫瘤消退。在一項(xiàng)臨床研究中，用FDA批準(zhǔn)的瘧疾治療藥物羥氯喹抑制自吞噬，這項(xiàng)單藥臨床在20例PDAC患者中進(jìn)行，療效非常有限，20例患者中18例出現(xiàn)PD。而羥氯喹術(shù)前護(hù)理聯(lián)合化療(吉西他濱+白紫)的結(jié)果比較振奮，整體緩解率和總生存都得到提升，同時(shí)血源腫瘤標(biāo)志物CA 19-9水平大大降低。
盡管用羥氯喹治療PDAC療效有限，但在PDAC及NRAS突變黑色素瘤的臨床前模型中，羥氯喹聯(lián)合MAPK通路的抑制劑顯示出令人鼓舞的結(jié)果。羥氯喹聯(lián)合曲美替尼在移植模型和PDX模型中能夠引起快速的腫瘤消退?；谶@個(gè)令人鼓舞的結(jié)果，目前評(píng)估曲美替尼聯(lián)合羥氯喹治療PDAC療效的1期臨床正在進(jìn)行中(NCT03825289)。
自吞噬抑制的精髓基本沒有涉及：
5.3 免疫療法
5.3.1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑
目前已經(jīng)有7個(gè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑獲FDA批準(zhǔn)，包括1個(gè)anti-CTLA4單抗(ipilimumab)，3個(gè)anti-PD1單抗(nivolumab、pembrolizumab和cemiplimab)和3個(gè)anti-PD-L1單抗 (atezolizumab、avelumab和durvalumab)，獲批的適應(yīng)癥包括NSCLC和黑色素瘤，也是RAS突變主要存在的4類腫瘤中的2種。高突變負(fù)荷、高表達(dá)PD-L1和TILs升高可被用來預(yù)測(cè)免疫治療的效果。由于有著免疫抑制微環(huán)境和低突變負(fù)荷，PDAC和CRC的免疫原性較低，所以免疫治療在這兩類腫瘤中療效一般也就不奇怪。但是其中的一小部分MSI-H或者dMMR的患者能夠?qū)γ庖咧委煈?yīng)答，像MSI-H在CRC和PDAC中的比例分別＜15%和＜20%，nivolumab和pembrolizumab也都因此獲批相應(yīng)的適應(yīng)癥。
臨床上NSCLC的患者接受anti-PD-1或anti-PD-L1單藥治療時(shí)只有10-20%才會(huì)獲得緩解，而突變譜能夠影響對(duì)免疫治療的緩解。單獨(dú)KRAS突變的NSCLC的ORR~28.6%，同時(shí)存在LKB1突變降低了對(duì)PD-1阻斷的ORR(7.4%)，而同時(shí)存在TP53突變ORR擇優(yōu)一定提升(35.7%)。
等位基因特異的RAS抑制劑或是MAPK通路中的其他抑制劑與免疫治療聯(lián)合后可以提升RAS突變腫瘤對(duì)免疫治療的應(yīng)答。有研究表明，KRAS突變的NSCLC中PD-L1水平升高，以提高免疫逃逸。RAD突變直接上調(diào)了PD-L1表達(dá)，但是這種上調(diào)可以被曲美替尼或者選擇性KRAS G12C抑制劑(ARS-853)逆轉(zhuǎn)。另外在免疫活性的小鼠模型中，AMG-510處理可以誘導(dǎo)促炎的腫瘤微環(huán)境，增加了TILs的數(shù)量，從未與anti-PD-1處理產(chǎn)生協(xié)同，AMG510聯(lián)合anti-PD-1或anti-PD-L1單抗治療NSCLC的臨床II期正在進(jìn)行中(NCT03600883)。MEK抑制劑同樣也能提高TILs的數(shù)量，在與anti-PD-1聯(lián)用是也協(xié)同性的引起腫瘤消退，事實(shí)上盡管atezolizumab聯(lián)合cobimetinib的組合在CRC中未能帶來臨床獲益，但是在NSCLC的臨床II期正在進(jìn)行(NCT03600701)。此外還有一項(xiàng)正在進(jìn)行中的臨床1期評(píng)估anti-PD-1單抗spartalizumab和SHP2抑制劑TNO155治療NSCLC(NCT04000529)。
5.3.2 過繼細(xì)胞療法
第二種治療治療RAS驅(qū)動(dòng)癌癥的免疫方法就是改造免疫系統(tǒng)，識(shí)別突變RAS蛋白相關(guān)的特異抗原，也被稱為過繼細(xì)胞療法，通過TILs或者轉(zhuǎn)基因改造的T細(xì)胞，離體擴(kuò)增后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)。TILs識(shí)別展示在腫瘤細(xì)胞表面的抗原，將擴(kuò)增后的TILs輸送回體內(nèi)能夠給黑色素瘤患者帶來臨床獲益。隨后技術(shù)發(fā)展可以改造并在外周血淋巴細(xì)胞表面表達(dá)TCRs，也能獲得類似的臨床獲益。
由于在黑瘤中成功鑒定出腫瘤特異性抗原，相似的方法也用于鑒定KRAS突變相關(guān)的特異的抗原。在1例轉(zhuǎn)移性CRC患者中鑒定能特異性識(shí)別KRAS G12D的CD8+ TILs，隨后向患者輸注擴(kuò)增的細(xì)胞，該患者的7個(gè)肺轉(zhuǎn)移病灶都有消退并且獲得了長達(dá)9個(gè)月的PR。另一例研究在NSCLC患者的CD4+ T細(xì)胞中鑒定出對(duì)KRAS G12V特異特異的TCR。這些結(jié)果顯示不管是KRAS G12D還是KRAS G12V來源的抗原在體內(nèi)具有免疫原性。
這些抗原被用來改造T細(xì)胞，wang和合作伙伴用突變的RAS肽來免疫HLA- A*11:01轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異性識(shí)別突變的T細(xì)胞。隨后在小鼠的T細(xì)胞中鑒定出TCRs，進(jìn)行克隆并通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)入外周血淋巴細(xì)胞刺激T細(xì)胞識(shí)別RAS G12D和G12V抗原。在腫瘤移植模型中，改造后的小鼠T細(xì)胞可以檢測(cè)人KRAS突變的PDAC細(xì)胞，引起腫瘤縮小甚至完全消退。目前基于該技術(shù)，有兩項(xiàng)分別靶向RAS-G12D和RAS-G12V的過繼細(xì)胞療法臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中(NCT03745326和 NCT03190941)。
5.3.3 腫瘤疫苗
治療RAS突變腫瘤的第三種免疫療法方法是使用已知的RAS突變腫瘤抗原通過疫苗接種引起T細(xì)胞應(yīng)答。一個(gè)類似的方法就是皮下同時(shí)注射突變的RAS蛋白的肽段和GM-CSF，刺激并激活DC并觸發(fā)對(duì)突變肽段的T細(xì)胞應(yīng)答。在一項(xiàng)I/II期中，PDAC患者接受Targovax公司開發(fā)的針對(duì)RAS突變特異的疫苗TG-01治療，顯示出患者免疫反應(yīng)增強(qiáng)，總生存期延長(NCT02261714)246。隨后其第二代疫苗TG-02治療CRC但結(jié)果尚未發(fā)表(NCT02933944)。
第二個(gè)方法就是針對(duì)通常KRAS突變(G12C、G12D、G12V和G13D)采用mRNA編碼新生抗原。肌肉注射用脂質(zhì)納米顆粒包裝的mRNA疫苗，隨后mRNA顆粒被APC攝入并翻譯后呈遞在細(xì)胞表面，誘導(dǎo)T細(xì)胞對(duì)突變RA新生抗原的免疫應(yīng)答。目前評(píng)估該類mRNA疫苗mRNA-5671單獨(dú)或者聯(lián)合K藥的1期臨床正在進(jìn)行中(NCT03948763)。
附：單藥治療的臨床
聯(lián)合治療的臨床
6 未來發(fā)展方向
KRAS-G12C等位基因特異性抑制劑將改變RAS驅(qū)動(dòng)腫瘤的治療前景。這些抑制劑有望成為FDA批準(zhǔn)的針對(duì)RAS突變型腫瘤的首批療法，并將用于治療RAS突變驅(qū)動(dòng)的難治性腫瘤，如PDAC、CRC和LUAD。盡管這些抑制劑的開發(fā)令人振奮，但新的挑戰(zhàn)和問題也將出現(xiàn)。
針對(duì)其他等位基因，如KRAS G12D和G12V的特異性抑制劑的開發(fā)仍在進(jìn)行中。這些等位基因是最常見的KRAS變異，覆蓋了最大一部分患者群體。最終會(huì)開發(fā)特異性抑制劑針對(duì)所有的RAS突變，為個(gè)體化治療提供選擇。靶向突變的RAS蛋白石最好治療RAS突變腫瘤的策略，但是用于單藥時(shí)療效一般，只有和其他治療聯(lián)合才會(huì)取得更好的療效。
至于哪種聯(lián)合策略將會(huì)取得最好的療效取決于以下幾點(diǎn)：
每種RAS變異都有獨(dú)特的生化特征，這些特征將決定對(duì)不同治療的應(yīng)答。例如，SHP2抑制劑RMC-455處理KRAS G12突變的細(xì)胞非常有效，并對(duì)KRAS G12C比KRAS G12D或KRAS G12V更有效。該觀察結(jié)果表明，SHP2和KRAS-G12C抑制劑的聯(lián)合將是一種有效的治療策略。開發(fā)聯(lián)合策略時(shí)必須了解特定RAS密碼子突變的要求和抑制劑對(duì)這些等位基因的反應(yīng)。
腫瘤類型會(huì)極大地影響緩解率，RAS突變的CRC和PDAC對(duì)MAPK抑制劑或免疫檢查點(diǎn)阻斷的應(yīng)答率很小。AMG 510早期臨床組，CRC比LUAD更難治療，表明CRC需要使用聯(lián)合療法。CRC的治療更需要挑戰(zhàn)，但是BRAF V600突變的轉(zhuǎn)移性CRC經(jīng)binimetinib、encorafenib和西妥昔單抗三聯(lián)治療取得了令人鼓舞的療效提示KRAS突變的CRC需要更強(qiáng)效的組合治療策略來獲得緩解。
從歷史數(shù)據(jù)來看，聯(lián)合療法更容易有毒副作用且安全性較差。然而AMG 510并未觀察到DLT，并且這種突變特異性療法脫靶作用有限。等位基因特異性抑制劑因?yàn)槎拘缘涂梢耘c毒性更大的其他抑制劑組合使用，而不用擔(dān)心會(huì)遇到像PI3K和MEK抑制劑這兩種毒性較大的化合物聯(lián)合后所觀察到的問題。
由于RAS突變的腫瘤的治療將會(huì)變得越來越個(gè)性化，因此需要評(píng)估對(duì)等位基因特異性抑制劑治療后可能出現(xiàn)的突變。腫瘤的異質(zhì)性將會(huì)引起各種內(nèi)源性的耐藥機(jī)制，例如一個(gè)腫瘤中可能包含95%的KRAS G12C細(xì)胞和0.1%的KRAS G12V細(xì)胞，一旦接受KRAS G12C抑制劑治療，將會(huì)引起腫瘤消退但最終KRAS G12V細(xì)胞會(huì)經(jīng)過選擇并引起復(fù)發(fā)。另外部分細(xì)胞亞群也會(huì)對(duì)KRAS G12C抑制耐藥，因此腫瘤異質(zhì)性也會(huì)引起內(nèi)源性耐藥。臨床前模型無法區(qū)分腫瘤異質(zhì)性，而只有臨床試驗(yàn)中的緩解才能澄清這一點(diǎn)。當(dāng)下關(guān)于KRASG12C特異性抑制劑治療后出現(xiàn)的新生突變類型的證據(jù)很少。
現(xiàn)在已知的EGFR和BRAF V600抑制劑治療后的耐藥機(jī)制將會(huì)給KRAS G12C抑制劑在臨床上引起的新生突變類型提供一些思路。Cys突變是其中一種常見的類型，尤其在EGFR共價(jià)抑制劑里面，但是在KRAS G12C中Cys本身就是腫瘤發(fā)生必須的，因此在臨床上很少見除非突變成其他的KRAS G12等位基因(如D和V等)。包括BRAF和RAS在內(nèi)的擴(kuò)增是一種對(duì)BRAF V600抑制劑耐藥的機(jī)制，而MET擴(kuò)增也在對(duì)EGFR抑制劑的耐藥中發(fā)現(xiàn)。而在這里，EGFR或上游EGFR家族其他成員的擴(kuò)增，將會(huì)升高GTP結(jié)合態(tài)的RAS水平，引起對(duì)抑制GDP結(jié)合態(tài)的KRAS G12C抑制劑耐藥。而不管是HRAS、NRAS，亦或是KRAS本身的擴(kuò)增，都會(huì)升高GTP結(jié)合態(tài)的RAS水平，從而引起對(duì)KRAS G12C抑制劑的耐藥。而BRAF突變腫瘤中最常見的獲得性耐藥機(jī)制就是NRAS或MEK1/2中的突變引起的MAPK通路的重新激活。因此有上游信號(hào)的改變(EGFR突變或擴(kuò)增、RAS擴(kuò)增)或下游信號(hào)的改變(RAF或MEK突變)等多種機(jī)制來重新激活MAPK通路，引起對(duì)KRASG12C等位基因特異的抑制劑的耐藥。
腫瘤類型的改變，如NSCLC轉(zhuǎn)化為SCLC，以及黑色素瘤中MITF的上調(diào)被認(rèn)為是EGFR和BRAF V600抑制劑耐藥的機(jī)制。另外上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型的重編程被認(rèn)為與NSCLC中EGFR及黑色素瘤中BRAF V600抑制的耐藥相關(guān)。特別是，對(duì)KRAF G12C抑制相關(guān)的轉(zhuǎn)錄機(jī)制可以提供RAS突變之外的腫瘤細(xì)胞狀態(tài)。上述耐藥機(jī)制需要全新的聯(lián)合策略來獲得更完全持久的抑制。
破壞RAS的GTPase的突變是另一個(gè)可能的耐藥機(jī)制，基于此假設(shè)，一項(xiàng)CRISPR篩選顯示NF1的缺失促進(jìn)了耐藥。更重要的是BRAF V600腫瘤中NF1的缺失就表現(xiàn)為對(duì)vemurafenib的耐藥，提示RAS突變的腫瘤可能也采取類似的機(jī)制。另外當(dāng)A59G這個(gè)阻斷GTPase的突變與KRAS G12C共存時(shí)，KRAS G12C主要以GTP結(jié)合態(tài)存在，等位基因特異的KRAS G12C的效果大大降低。當(dāng)然尚不清楚這個(gè)機(jī)制在不同的RAS突變和腫瘤類型間是否一致。
This is an exciting time to be at the forefront of ‘drugging the undruggable’ as there is new optimism that RAS- mutant cancers can be successfully treated.
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