酪氨酸激酶抑制劑（TKI）顯著改善了慢性髓性白血?。–ML）患者的預(yù)后，但仍有部分患者在TKI治療過程中出現(xiàn)耐藥。既往研究顯示，接受伊馬替尼治療的CML患者中，1年內(nèi)20%~30%患者發(fā)生耐藥[1,2,3]。BCR-ABL激酶區(qū)突變是TKI耐藥的主要機(jī)制之一，突變改變了BCR-ABL的構(gòu)象，影響其與TKI結(jié)合，進(jìn)而抑制TKI抗腫瘤效應(yīng)。其中，T315I突變患者對(duì)一代TKI（伊馬替尼）和二代TKI（尼洛替尼、達(dá)沙替尼）廣泛耐藥[4]。BCR-ABL激酶區(qū)突變是國內(nèi)外專家公認(rèn)選擇TKI治療CML患者時(shí)的重要參考[5,6]。國外已有多項(xiàng)研究報(bào)道TKI耐藥CML患者BCR-ABL激酶區(qū)突變的類型[7,8,9,10]，國內(nèi)也有研究報(bào)道中國TKI耐藥CML患者的突變類型，但病例數(shù)相對(duì)較少[11,12,13]。為此，本研究中我們回顧性分析了自2001年6月至2019年9月于北京大學(xué)人民醫(yī)院就診并發(fā)生TKI耐藥的CML患者，分析BCR-ABL激酶區(qū)突變?cè)谥袊鳦ML患者中的分布特征，并探究與BCR-ABL激酶區(qū)突變特別是T315I突變相關(guān)的因素。
回顧性收集2001年6月至2019年9月就診于北京大學(xué)人民醫(yī)院并發(fā)生TKI耐藥的CML患者臨床資料。CML的分期參考?xì)W洲白血病網(wǎng)（European Leukemia Net, ELN）指南標(biāo)準(zhǔn)[5]。
①一線TKI耐藥：采用ELN推薦中TKI作為一線治療反應(yīng)評(píng)估中的'治療失敗'標(biāo)準(zhǔn)：治療3個(gè)月時(shí)未達(dá)完全血液學(xué)反應(yīng)（CHR）或Ph 細(xì)胞比例>95%，治療6個(gè)月時(shí)BCR-ABLIS>10%或Ph 細(xì)胞比例>35%，治療12個(gè)月時(shí)BCR-ABLIS>1%或Ph 細(xì)胞比例>0，任何時(shí)間失去CHR、完全細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)（CCyR ，Ph 細(xì)胞為0）或主要分子學(xué)反應(yīng)（MMR，BCR-ABLIS≤0.1%），出現(xiàn)新的BCR-ABL激酶區(qū)突變，進(jìn)展至加速期或急變期，出現(xiàn)Ph 克隆演變（CCA/Ph ，Ph 細(xì)胞基礎(chǔ)上的其他克隆性染色體異常）。②二線TKI耐藥：治療3個(gè)月時(shí)未達(dá)CHR或Ph 細(xì)胞比例>95%，治療6個(gè)月時(shí)BCR-ABLIS>10%或Ph 細(xì)胞比例>65%，治療12個(gè)月時(shí)BCR-ABLIS>10%或Ph 細(xì)胞比例>35%，任何時(shí)間失去CHR、部分細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)（PCyR，Ph 細(xì)胞比例1%~35%）、CCyR或MMR，出現(xiàn)新的BCR-ABL激酶區(qū)突變，進(jìn)展至加速期或急變期，出現(xiàn)CCA/Ph 。③三線TKI耐藥：目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一的三線TKI耐藥標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用與二線TKI耐藥相同的標(biāo)準(zhǔn)。④原發(fā)耐藥：患者在治療初期即對(duì)TKI缺乏血液學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)或分子學(xué)反應(yīng)。⑤繼發(fā)耐藥：患者在獲得一段時(shí)間、一定程度的治療反應(yīng)后再次喪失反應(yīng)。⑥TKI耐藥次數(shù)：同一患者先后服用多種TKI，每發(fā)生一種TKI耐藥記為一次TKI耐藥。⑦BAR-ABL突變：同一患者先后發(fā)生多次TKI耐藥，每次TKI耐藥時(shí)檢出新的BCR-ABL突變類型記為服用該TKI時(shí)檢出的BCR-ABL突變。
采用紅細(xì)胞裂解法獲得CML患者骨髓或外周血中有核細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA?？俁NA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄成cDNA[14]，按既往報(bào)道的方法采用巢式PCR進(jìn)行ABL激酶區(qū)擴(kuò)增，PCR終產(chǎn)物為863 bp，對(duì)應(yīng)ABL蛋白的第219~506氨基酸[11]。將PCR測序結(jié)果與野生型ABL基因（美國GeneBank X16416.1）進(jìn)行序列比對(duì)，確定突變類型。
連續(xù)變量通過ROC曲線確定影響突變的界值。患者疾病特征采用描述性統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用Person卡方檢驗(yàn)。將單因素分析中P<0.2的因素納入二元Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
本研究納入804例CML患者，共發(fā)生1 093例次TKI耐藥，其中對(duì)伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥分別為576（52.7%）、238（21.8%）和279例次（25.5%）。男性710例次（65.0%），中位年齡38（4~83）歲，468例次（42.8%）合并其他疾病，162例次（14.8%）在開始服用當(dāng)前TKI時(shí)為進(jìn)展期（加速期或急變期），479例次（43.8%）曾有TKI減停用藥史。554例次（50.7%）為TKI原發(fā)耐藥。對(duì)當(dāng)前TKI耐藥時(shí)，有182（16.7%）、104（9.5%）、518（47.4%）和200例次（18.3%）分別處于進(jìn)展期、血液學(xué)耐藥（慢性期、但喪失或未達(dá)CHR）、細(xì)胞遺傳學(xué)耐藥和分子學(xué)耐藥。804例患者中，檢測T315I突變時(shí)所服用的TKI（一次或多次BCR-ABL突變檢測均未檢出突變者記首次檢測時(shí)所服用的TKI，檢出非T315I突變者記首次檢出該突變時(shí)所服用的TKI，檢出T315I突變者記首次檢出T315I突變時(shí)所服用的TKI）分別為伊馬替尼386例（48.0%），尼洛替尼182例（22.6%），達(dá)沙替尼236例（29.4%）；一代TKI 386例（48.0%），二代TKI 418例（52.0%）；一線TKI 423例（52.6%），二線TKI 273例（34.0%），三線及以上TKI 108例（13.4%）。對(duì)伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥患者的臨床特征詳見表1。
804例酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥慢性髓性白血病患者的臨床特征
804例酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥慢性髓性白血病患者的臨床特征
576例次伊馬替尼耐藥中，291例次（50.5%）檢出突變，其中54例次（9.4%）檢出至少2種突變。在所有44種BCR-ABL突變類型中，T315I突變發(fā)生率最高，共71例次（12.3%），其次為Y253F/H（43例次，7.5%）、F359V/C/I（32例次，5.6%）（圖1A）。P環(huán)突變共105例次（18.2%），包括Y253F/H（43例次，7.5%）、E255K/V（25例次，4.3%）、G250E（22例次，3.8%）、Q252H（8例次，1.4%）和L248V（7例次，1.2%）。
238例次尼洛替尼耐藥中，152例次（63.9%）檢出突變，其中25例次（10.5%）檢出至少2種突變。共檢出18種突變類型，其中T315I突變發(fā)生率最高（65例次，27.3%），其次為F359V/C/I（29例次，12.2%）、Y253F/H（28例次，11.8%）和E255K/V（25例次，10.5%），發(fā)生率均>5%（圖1B）。P環(huán)突變共62例次（26.1%），包括Y253F/H（28例次，11.8%）、E255K/V（25例次，10.5%）、G250E（8例次，3.4%）和Q252H（1例次，1.4%）。
279例次達(dá)沙替尼耐藥中，160例次（57.3%）檢出突變，其中24例次（8.6%）檢出至少2種突變。共檢出19種突變類型，其中T315I突變發(fā)生率最高（95例次，34.1%），其次為F317L/V/I/C（32例次，11.5%）、E255K/V（15例次，5.4%），發(fā)生率均>5%（圖1C）。P環(huán)突變共24例次（8.6%），包括E255K/V（15例次，5.4%）、G250E（5例次，1.8%）、Y253F/H（3例次，1.1%）和Q252H（1例次，0.4%）。
將檢出任意BCR-ABL突變作為終點(diǎn)，根據(jù)ROC曲線確定相應(yīng)連續(xù)變量的界值如下：在伊馬替尼、尼洛替尼、達(dá)沙替尼耐藥患者中，年齡分別為46、30和49歲，診斷至服用當(dāng)前TKI間隔分別為6、30和30個(gè)月，發(fā)生治療失敗至篩查突變間隔分別為6、0和1個(gè)月，治療失敗時(shí)當(dāng)前TKI服用時(shí)間分別為8、7和15個(gè)月，治療失敗時(shí)總TKI服用時(shí)間分別為8、7和17個(gè)月。將檢出T315I突變作為終點(diǎn)，根據(jù)ROC曲線確定相應(yīng)連續(xù)變量的界值如下：年齡為49歲，診斷至服用當(dāng)前TKI間隔為6個(gè)月，發(fā)生治療失敗至篩查突變間隔為0個(gè)月，治療失敗時(shí)當(dāng)前TKI服用時(shí)間為47個(gè)月，治療失敗時(shí)總TKI服用時(shí)間為14個(gè)月。
在伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥的CML患者中分別分析影響檢出突變的因素，單因素分析納入年齡、性別、共存疾病、開始服用當(dāng)前TKI時(shí)分期、診斷至服用TKI間隔、診斷至服用當(dāng)前TKI間隔、TKI減停用藥史、耐藥時(shí)當(dāng)前TKI服用時(shí)間、耐藥類型（原發(fā)耐藥或繼發(fā)耐藥；耐藥時(shí)處于進(jìn)展期、血液學(xué)耐藥、細(xì)胞遺傳學(xué)耐藥、分子學(xué)耐藥）、發(fā)生治療失敗至篩查BCR-ABL突變間隔等因素。在所有TKI耐藥CML患者中分析影響檢出T315I突變的因素，單因素分析時(shí)，除上述因素外，還納入了當(dāng)前TKI種類（伊馬替尼、尼洛替尼或達(dá)沙替尼；一代或二代；一線、二線或三線及以上）。單因素分析結(jié)果詳見表2和表3。
影響酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥慢性髓性白血病患者檢出突變的單因素和多因素分析
影響酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥慢性髓性白血病患者檢出突變的單因素和多因素分析
注：通過ROC曲線確定影響突變的界值：A：伊馬替尼耐藥46歲，尼洛替尼耐藥30歲，達(dá)沙替尼耐藥49歲；B：伊馬替尼耐藥6個(gè)月，尼洛替尼耐藥30個(gè)月，達(dá)沙替尼耐藥30個(gè)月；C：伊馬替尼耐藥6個(gè)月，尼洛替尼耐藥0個(gè)月，達(dá)沙替尼耐藥1個(gè)月；D：伊馬替尼耐藥8個(gè)月，尼洛替尼耐藥7個(gè)月，達(dá)沙替尼耐藥15個(gè)月；E：伊馬替尼耐藥8個(gè)月，尼洛替尼耐藥7個(gè)月，達(dá)沙替尼耐藥17個(gè)月
影響酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥慢性髓性白血病患者檢出T315I突變的單因素和多因素分析
影響酪氨酸激酶抑制劑（TKI）耐藥慢性髓性白血病患者檢出T315I突變的單因素和多因素分析
在伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥CML患者中分別分析影響B(tài)CR-ABL突變檢出的因素，多因素分析結(jié)果如表2所示，TKI減停用藥史是影響B(tài)CR-ABL突變檢出的共同因素，因不良反應(yīng)減停TKI的患者突變檢出率均較無TKI減停用藥史的患者更低。此外，男性、年齡小、無共存疾病、診斷至服用當(dāng)前TKI間隔時(shí)間長、服用當(dāng)前TKI時(shí)為進(jìn)展期、繼發(fā)耐藥、耐藥時(shí)處于進(jìn)展期或血液學(xué)耐藥和治療失敗時(shí)當(dāng)前TKI服用時(shí)間長的患者突變檢出率更高。發(fā)生治療失敗至篩查BCR-ABL突變時(shí)間間隔也與檢出突變相關(guān)，在伊馬替尼耐藥CML患者中，間隔>6個(gè)月的患者突變檢出率更高，而在達(dá)沙替尼耐藥CML患者中，間隔≤1個(gè)月的患者突變檢出率更高。
在所有CML患者中分析影響T315I突變檢出的因素，多因素分析結(jié)果顯示，男性（P=0.069）、診斷至首次服用TKI間隔>6個(gè)月、服用尼洛替尼或達(dá)沙替尼和繼發(fā)耐藥患者T315I突變檢出率更高，因不良反應(yīng)減停TKI和治療失敗時(shí)當(dāng)前TKI服用時(shí)間>47個(gè)月（P=0.051）的患者T315I突變檢出率更低（表3）。
我們的研究結(jié)果顯示，伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥CML患者BCR-ABL突變檢出率分別為50.5%、63.9%和57.3%，其中T315I突變檢出率均為最高，分別為12.3%、27.3%和34.1%。無TKI減停用藥史是影響伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥患者檢出突變的共同因素。對(duì)T315I突變分析顯示，男性、診斷至首次服用TKI間隔>6個(gè)月、服用尼洛替尼或達(dá)沙替尼和繼發(fā)耐藥患者T315I突變檢出率更高，因不良反應(yīng)減停TKI和治療失敗時(shí)當(dāng)前TKI服用時(shí)間>47個(gè)月的患者T315I突變檢出率更低。
既往研究發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥CML患者BCR-ABL突變檢出率分別為12%~63%、24%~28%和14%~27%，其中多項(xiàng)研究中T315I突變檢出率最高[15]。本研究中伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥CML患者BCR-ABL突變檢出率與既往研究報(bào)道一致。
本研究結(jié)果顯示，伊馬替尼、尼洛替尼或達(dá)沙替尼耐藥的CML患者中，無TKI減停用藥史患者突變檢出率高于因不良反應(yīng)減停TKI的患者。Vaidya等[16]發(fā)現(xiàn)BCR-ABL突變與TKI選擇壓力有關(guān)。因此，無TKI減停史患者突變檢出率高可能與TKI壓力性選擇作用更強(qiáng)相關(guān)。
尼洛替尼耐藥CML患者中，男性和年輕患者BCR-ABL突變檢出率更高。Pagnano等[17]報(bào)道了一項(xiàng)多中心回顧性研究，TKI（包括伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼）耐藥的CML患者中，檢出突變患者較未檢出突變患者中位年齡更小[49（15~89）歲對(duì)51（15~89）歲，P=0.01]，男性患者比例更高（64.1%對(duì)56.0%，P=0.08）。伊馬替尼和達(dá)沙替尼耐藥患者中，發(fā)生治療失敗至篩查突變間隔與突變檢出率相關(guān)，伊馬替尼耐藥患者間隔越長（>6個(gè)月），突變檢出率更高，而在達(dá)沙替尼耐藥患者中，間隔越短（<1個(gè)月），突變檢出率更高。這種差異可能是由于伊馬替尼多作為一線治療，而達(dá)沙替尼則多作為二線或三線治療。
我們的研究結(jié)果顯示，診斷至服用當(dāng)前TKI間隔長、耐藥時(shí)處于進(jìn)展期或血液學(xué)耐藥、繼發(fā)耐藥與BCR-ABL突變檢出率更高相關(guān)，與多項(xiàng)研究結(jié)果一致[8, 10,11]。
對(duì)影響T315I突變的因素分析顯示，尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥的CML患者較伊馬替尼耐藥患者T315I突變發(fā)生率更高，這可能是由于尼洛替尼和達(dá)沙替尼更多作為二線或三線治療，尤其達(dá)沙替尼在國內(nèi)尚未批準(zhǔn)作為一線治療。DASISION研究兩年隨訪結(jié)果顯示，達(dá)沙替尼組發(fā)生BCR-ABL突變的患者中，T315I突變占70%（7/10），而伊馬替尼組發(fā)生BCR-ABL突變的患者中無T315I突變[18]。Branford等[19]報(bào)道在伊馬替尼耐藥患者中，治療失敗時(shí)加速期或急變期患者較慢性期患者T315I突變檢出率更高。本研究未得到類似結(jié)果，可能是由于本研究中CML患者服用的TKI除伊馬替尼外，還包括尼洛替尼和達(dá)沙替尼。
本研究不足之處包括：①非前瞻性、隨機(jī)研究；②并非所有患者均規(guī)律監(jiān)測了血液學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子學(xué)反應(yīng)，一定程度上干擾了耐藥準(zhǔn)確時(shí)間、耐藥類型和突變檢出時(shí)間的判斷。
總之，我們的研究結(jié)果顯示，伊馬替尼、尼洛替尼和達(dá)沙替尼耐藥的CML患者，半數(shù)以上均檢測出BCR-ABL突變，其中T315I突變比例均為最高，人口學(xué)、疾病狀態(tài)和TKI用藥等臨床特征與BCR-ABL突變的檢出率和類型顯著相關(guān)。
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