撰文：huacishu
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1、該研究闡釋了腫瘤核型的改變率和多樣化模式，這為理解非整倍體基因組進化的歷史軌跡和時間動態(tài)提供了有價值的參數(shù)。
2、研究表明非整倍體腫瘤核型原則上可以在一個錯誤的細胞分裂中產(chǎn)生，為癌癥發(fā)生的早期階段惡性核型的間斷進化提供支持。
荷蘭烏得勒支大學Hugo Snippert教授團隊在國際知名期刊Nat Genet在線發(fā)表題為“Reconstructing single-cell karyotype alterations in colorectal cancer identifies punctuated and gradual diversification patterns”的研究論文。腫瘤進化的核心是遺傳多樣性的產(chǎn)生。然而，核型改變在人類腫瘤中出現(xiàn)和傳播的程度和模式尚不清楚，特別是在單細胞分辨率上。本文中作者提出了3D-實時序列方案，該方案整合了腫瘤類器官生長的活細胞成像和每個成像細胞的全基因組測序，用以重建連續(xù)細胞世代中進化的腫瘤細胞核型。利用患者來源的結(jié)直腸癌類器官和新鮮的腫瘤活檢，作者證明了不同復雜性的核型改變是普遍存在的，并且可以在幾個細胞世代內(nèi)出現(xiàn)。相反，在一次錯誤的細胞分裂中產(chǎn)生了全基因組的核型改變，為非整倍體腫瘤基因組可以通過間斷進化提供了支持。繪制癌癥核型多樣性的時間動態(tài)和模式具有重要意義。
為了研究在單個腫瘤細胞克隆生長過程中從頭染色體拷貝數(shù)變異（CNA）出現(xiàn)和繁殖的程度，作者開發(fā)了一種方案，允許對來自單個類器官的整個細胞群體進行單細胞全基因組測序（圖1a）。利用這個方案，對兩名結(jié)直腸癌（CRC）患者的克隆性腫瘤類器官中的高比例（約90%）細胞進行了重復測序：PDTO-9（微衛(wèi)星穩(wěn)定）和PDTO-19b（微衛(wèi)星不穩(wěn)定）。來自兩個PDTO的測序數(shù)據(jù)顯示細胞間從頭開始的全染色體以及亞染色體拷貝數(shù)變異（圖1b，c）。從單個克隆PDTO中捕獲整個細胞群具有檢測細胞間相互拷貝數(shù)增益和丟失的關(guān)鍵優(yōu)勢細胞，指示這兩個譜系是同一祖先拷貝數(shù)變異事件的后代（圖1b，c）。在整個數(shù)據(jù)集中，PDTO-9和PDTO-19b的拷貝數(shù)變異事件發(fā)生率約為十分之一（圖1d）。值得注意的是，作者確定了相同的拷貝數(shù)變異從單個PDTO-9類器官內(nèi)的獨立事件中出現(xiàn)的實例，這些實例通過同時出現(xiàn)額外的拷貝數(shù)變異來區(qū)分，這些拷貝數(shù)變異禁止組裝一致的單一系統(tǒng)發(fā)育（圖1b）。事實上，作者經(jīng)常檢測到多個拷貝數(shù)變異同時出現(xiàn)的細胞分裂。極端的病例表現(xiàn)為具有高度異常核型的PDTO-19b細胞亞群，被定義為可能顯著改變適應(yīng)性的全基因組倍性變化。其中兩個細胞在其基因組中顯示出廣泛的相互拷貝數(shù)變異（圖1c），表明它們是單個細胞分裂的后代。這兩種核型的總和都指向一個基因組重復的祖先，這與極端非整倍體狀態(tài)通常由不穩(wěn)定的四倍體中間體進化而來的模型一致。總的來說，這些數(shù)據(jù)表明新生拷貝數(shù)變異在PDTO生長期間很容易出現(xiàn)和傳播。
作者首先實現(xiàn)了3D實時序列，以研究新拷貝數(shù)變異是否與有絲分裂期間特定染色質(zhì)錯誤相關(guān)?？傊髡呱闪?4個細胞分裂的高分辨率成像數(shù)據(jù)，每個細胞分裂來自單個腫瘤類器官（PDTO-9），以評估它們的染色質(zhì)表型。然后對兩個子細胞以及由解離的PDTO結(jié)構(gòu)的剩余細胞組成的大樣本進行測序（圖2a）。正如所料，拷貝數(shù)變異幾乎只在涉及染色質(zhì)橋或滯后染色質(zhì)的細胞分裂的子細胞中產(chǎn)生（圖2b）。為了展示方案的可行性，記錄了單個PDTO-9類器官在三代細胞中未受干擾的生長，并重建了真實的有絲分裂，詳細描述了每個細胞分裂的有絲分裂保真度（圖2c）。在單細胞分離之前，作者選擇了一個感興趣的細胞進行光轉(zhuǎn)化，這是基于其之前細胞分裂過程中染色質(zhì)表型的滯后（圖2c）。來自13個細胞中12個細胞的單細胞測序數(shù)據(jù)顯示了跨越三個譜系的幾個拷貝數(shù)變異（圖2c）。利用光轉(zhuǎn)化細胞的測序結(jié)果作為標志，將7號染色體連續(xù)映射到有絲分裂樹內(nèi)突出顯示的分支（圖2c）。與之前的數(shù)據(jù)一致的是，7號染色體錯聚的分裂顯示了滯后的染色質(zhì)表型向獲得7號染色體拷貝的子細胞遷移（圖2c）。由于其潛在的系統(tǒng)發(fā)育解決方案與有絲分裂的多個分支匹配（圖2c），其余的拷貝數(shù)變異不能以高精度繪制。
在另一個PDTO-9 3D 實時序列數(shù)據(jù)集的光轉(zhuǎn)換譜系中遇到了染色體9q的類似擴增，這使得在四個細胞世代中可以準確地定位其系統(tǒng)發(fā)育起源（圖3a）。其中一個光轉(zhuǎn)化細胞中9q染色體的擴增和譜系內(nèi)所有其他細胞的相互丟失只能通過兩個復制周期和無著絲粒9q染色體片段的集體錯聚來協(xié)調(diào)。接下來，對細胞1（5個拷貝）、細胞2和3（1個拷貝）以及核型細胞（二倍體）進行了額外的深度測序，以提取每個染色體9q21.33端區(qū)域特有的單核苷酸變體（SNV）。正如預期的那樣，含有染色體9q擴增的細胞顯示SNV的有偏變異等位基因頻率，有利于一個親本等位基因，并且在一定程度上與兩輪復制一致（圖3b）。值得注意的是，在擴增的9q染色體片段中沒有發(fā)現(xiàn)顯色三倍體的跡象，這表明微核包膜保持完整。在每一個病例中，擴增的亞染色體片段都是無著絲粒的，這表明缺乏紡錘體微管連接導致復制的無著絲粒片段不分離。在后期，未連接的復制片段集體轉(zhuǎn)移到一個子細胞，可能導致隨機核或微核被遏制。
由于中心體擴增常常與全基因組加倍有關(guān)，假設(shè)由有絲分裂進入和退出缺陷引起的基因組復制細胞可以通過頻繁激發(fā)多極紡錘體缺陷作為產(chǎn)生有核型的有效底物。事實上，在一次再復制事件后捕捉到了一個三極分裂，它產(chǎn)生了三個核型相反的子細胞（圖4a）。為了證實上游有絲分裂滑脫引起的多極紡錘體缺陷能產(chǎn)生具有核型的子代，在有絲分裂滑脫后對細胞進行光轉(zhuǎn)換，并在下一次細胞分裂后分離出子代。正如預期的那樣，當兩個子細胞產(chǎn)生的染色質(zhì)質(zhì)量相等時，作者檢測到多倍體，但沒有全基因組的錯配染色體（圖4b）。相反，當下游分裂產(chǎn)生三個子細胞時，表明多極紡錘體缺陷，分離的細胞顯示出巨大的核型（圖4b）。
為了更詳細地研究細胞對核型的內(nèi)在選擇壓力，在生長早期和成熟階段捕獲了大量PDTOs中的單個細胞譜系。總的來說，從年輕到成熟的類器官，染色體不穩(wěn)定性的水平保持不變（圖5a）。在生長的兩個階段都很容易檢測到細胞凋亡，與以前的報道一致，在錯誤細胞分裂的后代中檢測到細胞凋亡水平升高，特別是在多極紡錘體缺陷后（圖5b，c）。對于仍處于增殖狀態(tài)的細胞，在出現(xiàn)錯誤后立即向較長細胞周期轉(zhuǎn)變并不顯著（圖5d）。然而，利用推導的似然比檢驗對有絲分裂樹結(jié)構(gòu)進行綜合分析，再次表明有絲分裂錯誤后出生率下降的證據(jù)。為了從功能上探討新核型的適合性，作者評估了來源于一個親本克隆PDTO的單個腫瘤細胞的類器官形成能力。隨后對新形成的單個類器官（體細胞）進行核型分析，可以作為種子單個細胞核型的替代物，并可以確認拷貝數(shù)變異的持續(xù)適合性。事實上，具有（亞）染色體核型改變甚至全基因組復制的細胞能夠發(fā)展成新的PDTOs（圖5e），這與作者的觀察一致，表明從細胞內(nèi)在和短期的角度來看，一些具有新核型的細胞保持高水平的適合性。
為了研究在由于選擇而重塑核型格局之前，晚期CRC是否在體內(nèi)產(chǎn)生相似程度的核型多樣性，作者采用測序方法來測量新鮮冷凍人類CRC樣本克隆譜系內(nèi)的核型多樣性。隨后的單細胞分離和前瞻性基因組分析顯示，細胞間的核型差異很大，近30%的細胞攜帶偏離核心腺體核型的拷貝數(shù)變異，這一數(shù)字與作者的PDTO數(shù)據(jù)一致（圖6a）。相反，只有來自野生型的少數(shù)單個細胞顯示出新發(fā)拷貝數(shù)變異，這與先前關(guān)于健康結(jié)腸組織中基礎(chǔ)染色體不穩(wěn)定性水平的報告一致（圖6b）。值得注意的是，通過捕獲大量克隆性腫瘤細胞（44%），檢測到體內(nèi)新生拷貝數(shù)變異的出現(xiàn)和繁殖（圖6a）。此外，很容易識別出具有巨大核型的細胞（圖6a），進一步證明在晚期癌癥階段正在產(chǎn)生具有全基因組核型改變的細胞。
該研究揭示了染色體不穩(wěn)定性在連續(xù)細胞世代中的基因組結(jié)果。通過重建中間基因組狀態(tài)，證明了全基因組和局部核型改變在晚期大腸癌中都是持續(xù)和普遍的。盡管如此，考慮到腫瘤可能由數(shù)千億個細胞組成，適應(yīng)性增強的低概率仍然具有潛在的影響。晚期癌癥核型多樣性的不斷產(chǎn)生與最近對患者隊列腫瘤基因組的分析是一致的。然而，由于這些研究大多衡量進化的凈結(jié)果，因此很難理清核型多樣性產(chǎn)生的速度以及影響它們形成非整倍體的選擇壓力。因此，對腫瘤核型的改變率和多樣化模式的洞察為理解非整倍體基因組進化的歷史軌跡和時間動態(tài)提供了有價值的參數(shù)。此外，作者的工作表明，非整倍體腫瘤核型原則上可以在一個錯誤的細胞分裂中產(chǎn)生，為癌癥發(fā)生的早期階段惡性核型的間斷進化提供支持。
教授介紹
Hugo Snippert博士是烏得勒支大學醫(yī)學中心分子醫(yī)學中心分子癌癥研究系的組長。2017年，他成為了一名腫瘤調(diào)查員。Hugo博士在漢斯·克利夫斯（Hubrecht研究所）的實驗室以優(yōu)等成績獲得博士學位，在那里，他利用先進的小鼠遺傳學和顯微鏡來描述小鼠腸癌、皮膚癌和腸癌中的干細胞群。他的主要研究領(lǐng)域涉及細胞死亡，以及多個單獨的細胞如何協(xié)同行動，以確保組織功能。Hugo教授還在國際權(quán)威期刊Cell、Nature Genetics、Nature Medicine上發(fā)表了多篇文章，主持撰寫了多部相關(guān)專業(yè)著作。。
參考文獻
Bollen Y, Stelloo E, van Leenen P, et al. Reconstructing single-cellkaryotype alterations in colorectal cancer identifies punctuated and gradualdiversification patterns [published online ahead of print, 2021 Jul 1]. NatGenet. 2021;10.1038/s41588-021-00891-2. doi:10.1038/s41588-021-00891-2
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