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染色體是遺傳物質(zhì)DNA的主要載體，其在細胞中的組成及形態(tài)特征被稱為核型（染色體組型）。不同的物種具有不同的核型，但是同一物種的核型是高度保守的，以常用的實驗動物小鼠為例，自人工繁育至今一百多年來所有的小鼠品系都維持了標準的40條染色體的核型。但是在漫長的生物演化過程中，染色體會發(fā)生重排，嚙齒類動物每百萬年就會積累3.2-3.5種染色體重排，而靈長類動物在每百萬年也會積累1.6種染色體重排。最典型的例子是靈長類動物進化過程中，兩條端著絲粒染色體通過羅伯遜融合形成了人類的2號染色體，而這兩條染色體在黑猩猩中卻仍然是分離的，因此人類有46條染色體，但黑猩猩卻有48條染色體【1】。進化生物學(xué)家認為染色體重排可能是導(dǎo)致生殖隔離建立的原因，甚至可能是物種產(chǎn)生的重要驅(qū)動力【2, 3】，但是這一假設(shè)尚未通過實驗生物學(xué)的手段進行證明。除了對于物種進化的重要意義，個體水平上發(fā)生的染色體重排往往會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如單親二倍化，不孕不育和兒童白血病等等。因此，在實驗室建立精準的染色體重排工程技術(shù)，對于研究染色體重排在物種進化、個體生殖發(fā)育與疾病中的作用具有重要價值。

近些年，隨著基因組編輯技術(shù)的進展，染色體精準重排率先在基因組組成簡單且為單倍體的酵母上獲得成功【4, 5】。但是哺乳動物基因組比酵母基因組復(fù)雜得多，目前對哺乳動物染色體的重排只限于亞染色體水平，在哺乳動物上進行完整染色體的重排仍然面臨巨大挑戰(zhàn)。

2022年8月26日，Science雜志以長文形式在線發(fā)表了中國科學(xué)院動物研究所，北京干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究院李偉研究員和周琪研究員團隊合作完成的題為A sustainable mouse karyotype created by programmed chromosome fusion的研究論文，報道了哺乳動物完整染色體可編程連接的新技術(shù)，創(chuàng)造出具有全新核型的小鼠，實現(xiàn)了哺乳動物大規(guī)?；蚪MDNA的編輯，在實驗室中成功模擬和解析了染色體重組的生物學(xué)效應(yīng)。

在哺乳動物細胞中如何將兩條完整的非同源染色體連接為一條？哺乳動物染色體通常按照大小順序由大到小（性染色體除外）進行編號。研究人員利用小鼠單倍體干細胞和Crispr基因編輯工具，將最長的染色體1號和2號（包括正反兩種形式）、以及中等長度的5號和4號染色體首尾連接，并且確定了連接的方式為非同源末端連接，如圖1A所示。為了更加直觀地觀察到染色體的連接，作者通過染色體DNA-FISH，核型分析，以及HiC等方式進一步確認了染色體的連接，同時發(fā)現(xiàn)染色體連接過程中可能會發(fā)生染色體的斷裂和重新連接，如圖1B所示。這些結(jié)果表明兩條獨立存在的染色體可以通過基因編輯后非同源末端連接修復(fù)的方式連接為同一條染色體。

圖1 小鼠單倍體干細胞染色體連接.（A）染色體連接示意圖（B）染色體連接DNA-FISH鑒定結(jié)果

染色體重排連接會對細胞的表型產(chǎn)生什么影響？前人研究發(fā)現(xiàn)并提出相關(guān)假說：染色體長度、細胞核大小和細胞大小三者存在內(nèi)在的關(guān)聯(lián)和調(diào)控，但是關(guān)聯(lián)方式和調(diào)控機制仍然不清晰。研究人員發(fā)現(xiàn)染色體連接后干細胞的多能性基因表達以及分化沒有發(fā)生明顯的變化；但是最長染色體連接（1號和2號染色體連接）的單倍體干細胞二倍化速率顯著加快；而且這種染色體倍性的變化趨勢不僅存在于單倍體細胞，在已經(jīng)成為二倍體的胚胎干細胞及神經(jīng)干細胞中，攜帶最長染色體連接（1號和2號染色體連接）的細胞仍會發(fā)生自發(fā)多倍化。為了探究這一現(xiàn)象發(fā)生的機制，研究人員通過免疫熒光染色的方法對連接細胞的有絲分裂進行觀察，發(fā)現(xiàn)有絲分裂末期連接的染色體會發(fā)生染色體橋聯(lián)現(xiàn)象。那么是否是因為染色體長度過長而導(dǎo)致有絲分裂末期姐妹染色單體不能正常分離，進而造成細胞不能正常分裂而核型加倍？為了確定這一假設(shè)，研究人員對連接的染色體分別進行截斷和恢復(fù)，結(jié)合染色體分離的實時觀察確認了染色體長度過長是導(dǎo)致細胞分裂異常的原因。綜合以上分析進行推論，哺乳動物細胞的染色體長度可能存在一定限制，這種染色體長度限制與細胞的大小有關(guān)；對小鼠細胞而言，染色體長度上限范圍可能在308.3Mb – 377.6Mb之間。

染色體重排連接會對小鼠的表型產(chǎn)生什么影響？為了回答這一問題，研究人員通過單倍體干細胞注射卵母細胞的方式成功得到染色體連接的小鼠，如圖2所示。研究發(fā)現(xiàn)，不同的染色體連接對小鼠產(chǎn)生了不同的影響，其中最長的染色體連接使得胚胎發(fā)育不能正常進行，胚胎停滯于E12.5之前；而染色體斷裂重新連接的小鼠則表現(xiàn)出了生長曲線和行為學(xué)的異常；但4號和5號染色體連接的小鼠則沒有表現(xiàn)出明顯的異常。染色體重排是否以及如何影響生殖呢？研究發(fā)現(xiàn)連接后的染色體能夠傳遞到后代小鼠，并且進一步交配可以產(chǎn)生純合小鼠，即只有19對染色體的全新核型的小鼠，證明兩條染色體的連接不會導(dǎo)致絕對的生殖隔離。但是攜帶連接染色體的小鼠生殖力明顯下降，進一步探索發(fā)現(xiàn)連接后的染色體仍然能夠與兩條分離的同源染色體進行正常聯(lián)會，但是聯(lián)會后的同源染色體分離會出現(xiàn)異常。這些發(fā)現(xiàn)解析了染色體連接會對小鼠發(fā)育、行為和生殖等產(chǎn)生多方面的影響，對于了解染色體重組如何影響物種的進化具有重要的參考價值。

圖2 染色體連接小鼠，攜帶有4號和5號染色體連接的小鼠。

最后，研究人員還綜合分析了染色體空間結(jié)構(gòu)在胚胎干細胞，神經(jīng)干細胞和腦內(nèi)的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)隨著分化的進行，染色體的空間結(jié)構(gòu)變化隨著分化而減弱。

綜上所述，該研究首次建立了哺乳動物完整染色體可編程連接的新技術(shù)，實現(xiàn)了對于超大規(guī)模基因組的編輯，為哺乳動物合成生物學(xué)增添了新的技術(shù)手段。同時，該工作發(fā)現(xiàn)了染色體長度的限制，為哺乳動物合成生物學(xué)進行染色體設(shè)計合成提供了重要參考。通過在實驗室小鼠模型中模擬染色體重排事件，研究了染色體重排的生物學(xué)效應(yīng)，為進化生物學(xué)研究提供了重要參考，為染色體異常疾病研究提供了模型構(gòu)建的方法。

中國科學(xué)院動物研究所博士后王立賓，副研究員李治琨，博士后王樂韻，博士后許凱和博士生季甜甜為本文的共同第一作者。中國科學(xué)院動物研究所與北京干細胞與再生醫(yī)學(xué)研究院的李偉研究員，周琪研究員為本文共同通訊作者。參與本課題的還有中國科學(xué)院動物研究所的毛伊幻，馬思楠，劉超，王麗穎，舒由嘉，楊寧以及安諾優(yōu)達基因科技有限公司的劉濤，涂成芳，趙倩和范旭寧。

專家點評

張曉宇，李勁松（中國科學(xué)院院士）

類精子干細胞介導(dǎo)半克隆技術(shù)實現(xiàn)全新核型小鼠模型的構(gòu)建

染色體的穩(wěn)定與變化是個體生存和物種演化的基礎(chǔ)，是遺傳物質(zhì)宏觀調(diào)控規(guī)律的一體兩面，染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異常常對個體造成不利影響，而新物種的形成往往又伴隨復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)演化。如何研究高等生物的基因組結(jié)構(gòu)組織規(guī)律？如何理解染色體結(jié)構(gòu)變異在細胞和個體生命活動中的意義？如何解析染色體結(jié)構(gòu)變異在生殖隔離建立以及物種演替中的做用？如何確定染色體變異疾病的產(chǎn)生、發(fā)展和傳遞的機制？這一系列的重要科學(xué)問題均需要科學(xué)家具有對生物尤其是高等哺乳動物的染色體進行遺傳改造建模的能力，但是改造哺乳動物染色體在技術(shù)上面臨極大的困難和挑戰(zhàn)。

染色體的結(jié)構(gòu)重組一方面為物種演化提供了原材料，另一方面也與諸多遺傳疾病和后天疾病例如白血病有關(guān)。基于系統(tǒng)生物學(xué)研究，距今約3~4百萬年前，人與黑猩猩的共同祖先內(nèi)部產(chǎn)生了染色體結(jié)構(gòu)上的分異，兩條獨立的染色體通過頭對頭（類似羅氏易位，Robertsonian translocation）方式融合成為現(xiàn)今現(xiàn)代人的二號染色體（HSA2），這一改變可能直接導(dǎo)致了人類始祖與黑猩猩始祖之間的生殖隔離，成為人類物種演化的關(guān)鍵性事件【6】。染色體融合是一種人類染色體結(jié)構(gòu)變異中常見形式，平均1000名新生兒中就有1例羅氏易位病例，發(fā)病率高【7】。已有研究表明具有15號和21號染色體羅氏易位的新生兒患急性淋巴白血病的患病風險會提高2700倍【8】。此外，羅氏易位會造成配子質(zhì)量下降，在減數(shù)分裂過程中產(chǎn)生紊亂，導(dǎo)致配子數(shù)目異常，最終產(chǎn)生唐氏綜合癥、Patau綜合癥等嚴重的出生缺陷【9】。

因此，可以說在單基因/多基因復(fù)雜遺傳疾病均可以高效建模的今天，突破哺乳動物個體水平染色體遺傳改造的技術(shù)瓶頸是遺傳學(xué)家一項重要的科學(xué)使命。

2018年，中國科學(xué)家團隊率先實現(xiàn)基于酵母的大規(guī)模染色體改造，成功將酵母染色體合并為一條，并研究了染色體重塑對酵母生理活動的影響（Nature突破丨中國學(xué)者創(chuàng)造單條融合染色體酵母——元英進、戴俊彪等解讀）【10,11】。這一重大突破激發(fā)了科學(xué)家思考核內(nèi)染色體空間組織模式在真核生物基因組穩(wěn)態(tài)及生長發(fā)育中的作用。在更高級的哺乳動物層面上開展染色體改造的研究呼之欲出。

2022年8月26日，中科院動物所研究團隊在Science上發(fā)表的這一原創(chuàng)性工作，一舉將染色體結(jié)構(gòu)人工遺傳改造推高到哺乳動物個體水平，突破了人工編程化改造哺乳動物基因組的最大技術(shù)瓶頸。在本項研究中，研究人員基于小鼠參考基因組設(shè)計了特異性基因編輯方案，通過分別移除小鼠孤雄單倍體胚胎干細胞（又可稱為類精子干細胞）的兩條端著絲粒染色體的端粒端和著絲粒端，將兩條染色體融合在一起。研究人員發(fā)現(xiàn)了Chr1和Chr2首尾融合形成的超長染色體存在較強的有絲分裂異常，此外研究人員還巧妙地以Chr17染色體作為受體，對超長的融合染色體進行截短回補實驗修復(fù)了超長染色體帶來的有絲分裂異常，這暗示了小鼠染色體可能存在長度界限。類精子干細胞可以替代精子使卵母細胞“受精”產(chǎn)生半克隆小鼠的特性支持了染色體融合改造小鼠的一步構(gòu)建【12,13】。本項研究中研究人員通過將染色體融合改造的類精子干細胞注射入卵母細胞，獲得Chr4+5和Chr1+2兩種類型的雜合半克隆小鼠，兩類小鼠表現(xiàn)出行為和生殖能力上的差異，其中攜帶Chr4+5融合染色體的半克隆小鼠沒有表現(xiàn)出明顯的異常，并可以通過配子向下傳遞，獲得了三只攜帶19對染色體的小鼠。這些結(jié)果暗示了染色體結(jié)構(gòu)變異在個體行為上存在著深層次影響，同時，攜帶融合染色體的小鼠的建立，構(gòu)建了從“新染色體”設(shè)計到“新物種”建立的技術(shù)路線。

值得一提的是，本項研究創(chuàng)造的新的染色體融合方式（首尾連接染色體）在自然界中尚未被發(fā)現(xiàn)，但這并不能排除在演化的歷史長河中出現(xiàn)過類似的染色體首尾連接模式，然而，由于與有絲分裂和胚胎發(fā)育等生命活動不兼容而沒有被保留下來。揭示物種演化過程中的頻繁的基因組重組背后的邏輯以及其對應(yīng)的演化意義是研究者們未來需要進一步深入思考的科學(xué)問題。

本項研究的發(fā)表，使得科學(xué)家進行染色體結(jié)構(gòu)改造一步躍升到哺乳動物的個體層面，開啟了以小鼠為代表的哺乳動物染色體遺傳改造的新領(lǐng)域，同時也是“類精子干細胞”介導(dǎo)半克隆技術(shù)的一項新的顛覆性應(yīng)用。染色體結(jié)構(gòu)變異類型多樣，除本文創(chuàng)造的染色體首尾融合方式，還包括染色體頭對頭融合模式的羅氏易位、染色體末端融合形成的環(huán)狀染色體、染色體臂間倒位等多種染色體結(jié)構(gòu)變異類型。其中環(huán)化染色體是人類中存在的一種罕見染色體結(jié)構(gòu)變異遺傳疾病，患者的染色體融合環(huán)化，產(chǎn)生一系列發(fā)育遲滯等疾病表征【14】。但是，由于缺乏手段，目前尚未有環(huán)化染色體疾病動物模型被成功建立?；诨蚓庉嫻ぞ吆皖惥痈杉毎夹g(shù)，未來可以實現(xiàn)包括羅氏易位模型、環(huán)化染色體模型、臂間倒位模型等一系列個體水平的染色體改造，為研究物種演化和染色體異常遺傳疾病等領(lǐng)域提供強有力支撐。

可以預(yù)見，類精子干細胞介導(dǎo)半克隆技術(shù)作為銜接細胞和個體的強有力遺傳載體，未來在合成生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的加持下會煥發(fā)的巨大活力。人工改造物種及人工定制物種成為可能，高等生物全基因組設(shè)計重排也不是幻想?；蛟S未來某一天回顧科學(xué)發(fā)展歷程，我們可以定義2022年為哺乳動物染色體尺度基因組重塑元年。

原文鏈接：

http://doi.org/10.1126/science.abm1964

制版人：十一

參考文獻

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12. Li, W. et al. Androgenetic haploid embryonic stem cells produce live transgenic mice. Nature 490, 407-411 (2012).

13. Yang, H. et al. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell 149, 605-617 (2012).

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