2019年新型冠狀病毒（2019-nCoV，后文簡稱新冠病毒）是一種單鏈RNA冠狀病毒，基因組序列由29903bp構成，該基因組擁有10個基因，可以有效地編碼了10個蛋白。它可引起呼吸道感染，目前WHO已確定其名稱為其感染所致肺炎目前已統(tǒng)一命名為“新型冠狀病毒肺炎（Novel coronavirus pneumonia，NCP）”。由于疫情發(fā)展迅速，及時對不同程度臨床癥狀病人及疑似患者進行診斷需要快速有效的方法，新冠病毒RNA檢測可為診斷提供直接證據，在目前最新版本（新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版））的診療方案中，新冠病毒核酸的檢出仍是唯一確診依據。作為一名檢驗人，此時肩上擔負了大量疑似病人的確診工作，連續(xù)奮戰(zhàn)在抗擊疫情的一線。由于是一項新的檢測，從新冠病毒所致疾病病程到新冠病毒核酸檢測技術等各個方面都缺乏大量科學數據的支撐，各臨床實驗室在開展核酸檢測的過程中也遇到了很多問題。如何保證核酸檢測結果的及時性和準確性？怎樣面對核酸檢測中一些尚無標準的操作流程及其可能造成的一系列問題？別急，華西檢驗來幫你參考！
01
新冠核酸檢測疑問之技術原理
為什么熒光定量PCR會成為臨床最為廣泛應用的檢測方法？要滿足臨床對新冠病毒核酸檢測的要求至少需要檢測幾個基因/位點？
答：在疫情初期，面對新的病原體，最先檢出的方法是NGS (next-generation sequencing)技術，暨下一代測序技術/高通量測序技術，并很快確定了新冠病毒的核酸序列。在病毒核酸序列確定的情況下，通過對其保守區(qū)域進行引物探針設計及靶向PCR檢測無疑是最為簡單及快速的檢測策略。目前也有非常多的快速基因檢測技術推出，如現場快速檢驗（POCT）技術等，整個檢測流程縮短很長時間，有報道稱最快可以節(jié)約3-4小時。和傳統(tǒng)的熒光定量PCR（RT-PCR）技術相比，一體化現場快速檢測確實便攜、操作簡單，但是如果過于強調其“快速”的特性，其靈敏度可能受影響，而現實的問題是傳統(tǒng)PCR技術都受到的“假陰性”結果的挑戰(zhàn)。在現有條件下，時間的縮短可能會帶來一定程度的靈敏度的犧牲。從技術的角度看，在靈敏度和特異性的平衡上，相比較一些快速檢測方法，目前平衡的最好的仍是RT-PCR檢測技術。從過往的重大疫情來看，無論是西非埃博拉病毒、甲流還是中東呼吸綜合征，RT-PCR仍是國家首推的檢測手段。
目前新冠病毒核酸檢測針對的位點主要包含病毒基因組中3段保守基因序列，即開放讀碼框1ab（Open reading frame 1ab，ORF1ab）、 核 殼 蛋 白 （Nucleocapsid protein，N）基因以及包膜蛋白(Envelop，E)基因作為檢測靶標。根據國家衛(wèi)健委發(fā)布的新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南（第四版），在實驗室要確認一個病例為陽性，需滿足同一份標本中新冠病毒的ORF1ab及N基因 2個靶標特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。如受實驗室檢測試劑盒限制，只能做一個靶標的檢測的話，應至少針對新冠病毒最為保守及特異的ORF1ab區(qū)域進行檢測。
目前是否只能取呼吸道樣本進行新冠病毒核酸檢測？在其他類型樣本中能檢測到病毒核酸嗎？
答：在最新版的新冠肺炎診療方案中（第五版），其確診所提到的樣本類型包含了呼吸道樣本以及血液樣本，同時在實驗室檢查中增加了“糞便樣本中可檢測新型冠狀病毒核酸”。由于新冠病毒造成的肺炎為下呼吸道感染，對于已有癥狀及肺部CT改變的患者來說，下呼吸道樣本（如深部咳痰、灌洗液等）為核酸檢測首選，而在新冠肺炎不同的病程中取上呼吸道樣本（如鼻咽拭子等）也能檢出病毒核酸；
隨著對新冠病毒核酸檢測的科技攻關，目前已有較多報道提出在患者的糞便樣本中可檢出病毒核酸，甚至有報道提出糞便樣本的核酸檢測陽性率高于上呼吸道樣本。因此對于四川省內的醫(yī)療機構，省委建委及時下發(fā)了《關于全面開展新型冠狀病毒肺炎病人糞便標本核酸檢測的通知》，并在日前剛剛發(fā)布了相應的糞便采集及核酸檢測技術規(guī)范，糞便樣本也將成為臨床患者篩查的重要樣本類型。目前我們華西團隊已開始對呼吸道樣本核酸檢測確診的患者進行治療過程中及出院前的糞便樣本進行核酸檢測，研究結果顯示糞便樣本是病人診療過程中的一種非常好的檢測目標，同時糞便核酸的陽性與病人的疾病進程的發(fā)展具有重要的相關性，可能作為一種治療療效評估和出院標準的重要檢測指標。而目前我們華西團隊對臨床患者的血清和尿液樣本進行病毒核酸檢測還未檢測出陽性結果。
臨床已廣泛開展新冠病毒RNA的熒光定量PCR檢測，但是不同醫(yī)院的實驗室條件不同，對于樣本核酸的提取采用的方法不一，那么提取方法是否對檢測結果有影響呢？
答：熒光定量PCR是臨床分子檢測中常用的檢測方法，在以往采用RT-PCR對病毒核酸進行的檢測中，磁珠法是較為常用的核酸提取方法，普遍認為其對病原體的核酸提取具有簡便、高效、提取濃度及純度較高等優(yōu)勢。此外因各實驗室條件不同及針對的病毒的試劑盒不同，離心柱法、煮沸裂解法、一步裂解釋放法等也在臨床大量應用。不同的病毒核酸提取方法因其提取產物濃度、純度的差別以及對RNA的保護程度不同，將在一定程度上影響病毒核酸尤其是臨界陽性樣本的核酸檢出。病毒核酸提取方法的選擇對于最終的檢測結果的影響非常重要，建議各實驗室根據自身情況合理選擇，有條件可進行一定量的比對試驗作為選擇的依據。根據我們目前現有條件，我們初步對患者原始樣本（帶病毒保存液的咽拭子樣本）采用不同提取方法后的檢測結果顯示：分別采用離心柱法及磁珠法提取后，PCR檢測的CT值無顯著差異（p＞0.05），節(jié)選某一樣本的結果圖如下：
02
新冠核酸檢測疑問之實驗室生物安全
之前公眾號已經推文介紹了一些進行新冠核酸檢測的生物安全問題，對于條件有限的實驗室，能否再次簡單總結下進行核酸檢測的人員到底應該怎樣防護？實驗室應至少提供什么條件？
答：新冠病毒目前暫按照病原微生物危害程度分類中第二類病原微生物進行管理。根據最新版的新冠病毒實驗室生物安全指南，如無法對原始樣本進行可靠的滅活，則對其進行的核酸檢測應當在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護（建議至少穿戴工作服、一次性工作帽、雙層手套、醫(yī)用一次性防護服、醫(yī)用防護口罩或動力送風過濾式呼吸器、防護面屏或護目鏡、工作鞋或膠靴、防水靴套），各實驗室還可根據自身情況增加進一步的防護；同時標準預防、不定期通風和手衛(wèi)生等重要的防護措施必不可少。
在物資匱乏及實驗室條件不足等限制下，實驗室應根據物資短缺的情況，啟動分層的生物安全防護預案。建議至少應對直接面對病人的窗口工作人員和接觸呼吸道樣本的相關人員嚴格執(zhí)行生物安全三級防護，其他實驗室檢測人員酌情采取生物安全二級或一級防護，同時加強所有實驗室人員的安全意識，檢測后按照相關的生物安全要求對進行新冠病毒核酸檢測操作的安全柜、臺面及實驗室環(huán)境及時進行有效的消毒。
進行核酸檢測的實驗室人員攜帶病毒回家的可能性？每日核酸檢測工作結束后的消毒建議？
答：在日常進行新冠病毒核酸檢測的實驗室內，所有實驗人員均應嚴格遵循新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（最新版）中的相應要求，在實驗室環(huán)境適時消毒、實驗人員安全防護到位、實驗操作嚴格按照相應生物安全進行的情況下，實驗室核酸檢測人員下班后攜帶病毒回家的可能性是較小的。
結束核酸檢測工作后，應注意嚴格按照相關文件要求進行防護裝備的脫卸，注意盡量少地觸碰到污染面，且脫卸的每一步后均應有手消毒，防護服、醫(yī)用帽及醫(yī)用口罩等一次性物品盡量不重復使用，在全部脫卸完成后，再進行相應的手衛(wèi)生及消毒。對于嚴格分區(qū)的實驗室，在相應區(qū)域完成防護裝備脫卸及手衛(wèi)生即可進入清潔區(qū)。對于條件有限的實驗室，在完成防護裝備脫卸、處理及手衛(wèi)生后，建議噴灑75%酒精等進行有效消毒后，再離開實驗室。
關于原始樣本的滅活，目前文件及指南中提到多個溫度條件，是否會造成核酸檢測結果的差異？
答：目前最新的新冠病毒核酸檢測專家共識中，建議采用56℃水浴45min，并可根據提取試劑在標本裂解時所采用的溫度調整滅活溫度，但不低于56℃，同時也建議滅活條件有預實驗結果支持。根據我們目前的初步試驗結果來看，同一陽性樣本經過56℃干浴30min以及65℃干浴30min后，其PCR檢測的陽性CT值無明顯差異，節(jié)選某一樣本的結果圖如下：
此前，華中科技大學附屬同濟醫(yī)院檢驗科的老師們也對PCR檢測病毒核酸做過相應的小樣本量比對，結果發(fā)現未滅活處理、56℃水浴30min及50℃干浴1h的同一樣本其PCR檢測陽性結果的CT值無明顯變化，也可作為新冠病毒樣本滅活的參考。
03
新冠核酸檢測疑問之結果判定
目前新冠病毒感染還是通過核酸確診，到底需要幾次送樣或者幾次檢測結果才能確診陽性呢？
答：根據目前的新冠病毒診療指南及實驗室檢測專家共識，對新冠病毒的核酸檢測均應至少檢測ORF1ab及N基因，同時陽性時可判定為陽性；我們對于初診患者，建議：如第一次樣本檢測結果為陽性，將采用同一檢測方法的另一廠家試劑盒或采用目前實驗室可進行的另一檢測方法對樣本進行復核，結果仍為陽性時，可作為確診。
臨床檢測中存在較多的單陽結果，是什么原因？遇到這樣的樣本怎么處理？
答：目前臨床在用的不同廠家熒光雙位點定量PCR試劑盒普遍對于新冠病毒N蛋白基因的擴增敏感性高于ORF1ab檢測，可能導致部分病毒含量較低的樣本檢測結果為單通道陽性；此外，由于N基因在新冠病毒的核酸序列中，其保守程度不及ORF1ab，故可能存在不同冠狀病毒間有一定的交叉，導致N基因擴增陽性而ORF1ab陰性。
我們對于臨床上樣本檢測結果為單通道陽性的，需要謹慎對待，應采用同一檢測方法的另一廠家試劑盒或采用目前實驗室可進行的另一檢測方法對樣本進行復核，如第二次結果為陰性，則報告陰性，并根據相應文件要求需間隔1天以上再次對同一病人進行取樣檢測，兩次陰性結果可初步排除感染，但仍需結合臨床癥狀及CT檢查結果考慮進一步的核酸檢測策略；而第二次結果仍為單通道陽性的樣本，將建議臨床重新取該患者樣本送檢。同時，需要高度關注核酸提取效率影響病毒核酸檢測結果，如出現單通道陽性結果也可以采用換提取方法重新提取核酸進行重新檢測。
04
最后，我們分子檢驗人最關心的——新冠核酸檢測的假陰性問題
新冠病毒RNA的檢測目前以熒光定量RT-PCR為主，由于造成核酸檢測假陰性結果的原因已有大量的文章進行分析，這一部分我們就著重分享一些在新冠病毒臨床檢測開展中實際遇到的問題及一些分析。
作為一項病毒核酸檢測項目，跟所有的實驗室檢測一樣，其結果影響因素也涵蓋了檢測前、檢測中、檢測后各個方面。而又由于新冠病毒主要采取呼吸道樣本進行檢測，新冠肺炎患者又少有深部咳痰等下呼吸道樣本，因此其檢測前因素對核酸檢測結果的影響比重較大。樣本的滅活等預處理及樣本核酸提取在前面已有提及，我們這里主要分析一下樣本類型以及采樣耗材類型對核酸檢測的影響。
已有報道提出呼吸道樣本中的新冠病毒核酸檢出率順序為肺組織（金標準）>支氣管肺泡灌洗液（BALF）>抽吸痰或咳痰>鼻咽拭子或口咽拭子>鼻拭子。我們在臨床上針對同一患者不同類型呼吸道樣本進行核酸檢測，結果初步提示在新冠病毒感染者中，取咽拭子樣本及深部痰樣本的病毒核酸檢出率之間有一定差異，雖然沒有做病毒定量檢測，但我們推測在呼吸道病毒量較低的患者中，咽拭子檢測的敏感性將明顯低于深部痰，部分樣本結果如下表所示。
患者編號 | 鼻咽拭子核酸檢測結果 | 深部咳痰核酸檢測結果 |
1 | 陰性 | 陽性 |
2 | 弱陽性 | 陽性 |
3 | 陰性 | 陰性 |
4 | 陽性 | 陽性 |
5 | 陰性 | 弱陽性 |
6 | 弱陽性 | 陽性 |
7 | 陰性 | 陰性 |
8 | 陽性 | 陽性 |
9 | 陽性 | 陽性 |
10 | 陰性 | 陽性 |
11 | 陽性 | 陽性 |
12 | 陽性 | 陽性 |
13 | 陽性 | 陽性 |
14 | 陽性 | 陽性 |
15 | 陽性 | 陽性 |
此外，臨床常用的鼻、咽拭子其病毒核酸檢出率與病毒感染進程密切相關，而目前對新型冠狀病毒的病程轉歸并不完全清楚，采樣的最佳時機不確定，很可能錯過鼻、咽拭子樣本內病毒載量高的時期，即使按照目前已發(fā)布的標準采樣流程進行操作，也不能保證新冠病毒感染者的檢出率。故臨床上還是應盡量保證樣本類型為下呼吸道樣本，鼻、咽拭子等樣本建議病程中多次取樣檢查。
對于呼吸道樣本的病毒核酸檢測來說，不同的拭子及保存管也將影響核酸檢測結果，我們對比同一患者帶病毒保存液的植絨拭子樣本及無病毒保存液的普通棉簽拭子樣本檢測結果，發(fā)現普通棉簽拭子的核酸檢出率明顯低于帶病毒保存液的植絨拭子（p＜0.05），即便檢出，其陽性CT值也遠高于植絨拭子。節(jié)選某一樣本的檢測結果如下：
另一方面，由于目前臨床在用的試劑盒廠家眾多，加之研發(fā)時間緊迫，沒有足夠的評估及大樣本的臨床驗證，故不同的試劑盒其方法性能也可能有較大差別，臨床上建議對可疑結果及單通道陽性結果的樣本，均用另一廠家試劑盒或另一方法的試劑盒復核，且所有在用的試劑盒都應有內部參照來指示提取及擴增的有效性；此外，只要是熒光定量PCR檢測，都存在一個檢測限，如各實驗室有定量的條件，可考慮采用常規(guī)新冠核酸檢測試劑盒對已知病毒載量的樣本進行一個驗證，其檢測限應不高于102-103copies/mL。如有必要，可考慮對樣本進行測序檢測，目前實驗室已開始檢測新冠病毒IgM及IgG抗體，更敏感的核酸檢測方法如數字PCR也有一定的應用，有望在新冠病毒的實驗室檢測方面大大降低假陰性率。
最后：由實驗醫(yī)學科周易副教授為大家簡介新冠核酸檢測的流程
文本審校：應斌武
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