4月6日，成都醫(yī)學院賈旭、中國醫(yī)學科學院輸血研究所何苗聯(lián)合資陽市第一人民醫(yī)院林勝在MedRxiv上發(fā)表了一篇論文，題為“A case of SARS-CoV-2 carrier for 32 days with several times false negative nucleic acid tests”，報道了一例連續(xù)32天檢測假陰性的新冠病毒攜帶者。
真的是“神了奇”了！
目前，RT-PCR方法的檢測以SARS-CoV-2 基因組中開放讀碼框lab（Open reading frame 1ab,ORF-lab）、核殼蛋白（Nucleocapsid, N）基因 和（或）包膜蛋白（Envelop,E）基因等作為檢測靶標。
２０２０年２月２１日國家衛(wèi)健委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》中強調(diào)，確診病例需滿足同一份標本中SARS-CoV-2的ORF-lab及Ｎ 基因的２個靶標RT-PCR檢測均為陽性，或２種類型標本的RT-PCR同時出現(xiàn)單靶標陽性，或同種類型標本２次采樣的RT-PCR均出現(xiàn)單靶標陽性。
然而，臨床實踐中并非所有COVID-19 患者均可通過常規(guī)采樣標本檢測出SARS-CoV-2核酸。按照第五版實驗室檢測技術(shù)指南的要求，每例疑似病例和聚集性病例均須采集急性期上呼吸道或下呼吸道標本；重癥病例優(yōu)先采集深咳痰液、肺泡或支氣管灌洗液等下呼吸道標本。但由于多數(shù)COVID-19 患者咳痰及下呼吸道標本取樣操作困難，且生物安全風險極大。因此，臨床常規(guī)采集的呼吸道標本仍以鼻、咽拭子為主；而拭子樣本采用現(xiàn)有RT-PCR試劑，陽性檢出率僅為３０％～５０％，大量的“假陰性” 結(jié)果無法避免。目前，全國各地多家醫(yī)療機構(gòu)均出現(xiàn)過SARS-CoV-2 核酸檢測“假陰性”的案例，甚至有的確診病例先前的多次核酸檢測均呈陰性，致使實驗室檢查與臨床癥狀、影像學特征不相符，嚴重影響臨床診療，甚至延誤整體的疫情防控。相對于假陰性，假陽性則較少見。
那么新冠病毒核酸檢測的假陰性/假陽性有哪些原因呢？下面就整體分析一下，有什么不足的希望批評指正！
1、核酸檢測“假陰性”原因：
PCR反應中任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都可能導致假陰性結(jié)果，應從PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中找到原因，比如：模板核酸的制備、引物的質(zhì)量與特特性、酶的質(zhì)量及活性、PCR反應條件、PCR反應產(chǎn)物鑒定等等。以下為一些新冠病毒檢測假陰性的原因分析：
①、檢測試劑的有效性:
前期，由于疫情形勢的嚴重性和緊迫性，現(xiàn)有核酸檢測試劑盒多數(shù)經(jīng)國家藥監(jiān)局應急審批程序緊急批準上市，這種舉措雖然有效地緩解了疫情防控工作中因檢測試劑不足導致似病例無法盡早確診的問題，但也因缺乏足夠的時間對檢測試劑進行先期臨床試驗，不可避免地存在部分產(chǎn)品的有效性難以保證。
比如純化問題：影響核酸提取純化的因素包括裂解效率、中和沉淀、結(jié)合效率、洗脫效率。同時，洗脫產(chǎn)物若含太高的鹽分或乙醇會抑制后續(xù)的PCR反應。對于含有免疫細胞的標本里含有RNase或者使用的耗材、緩沖液含有環(huán)境中的RNase，導致RNase污染；新冠病毒是單鏈RNA，GuHCI或GuSCN中易降解，不易暴露時間過長。
由于引物或探針降解、引物或探針設(shè)計不合理而造成的CT值出現(xiàn)過晚或無 CT信號出現(xiàn)。優(yōu)化方案是設(shè)計更好的引物或探針；優(yōu)化引物濃度和退火溫度。 避免引物或探針降解，可在進行實時定量 PCR 實驗前通過電泳檢測其完整性。
逆轉(zhuǎn)錄酶：與Taq酶相比，逆轉(zhuǎn)錄酶相對脆弱，活性保持或獲得高活性的逆轉(zhuǎn)錄酶相對不易。純化制品中可能存在RNase污染。
引物探針設(shè)計局限：目前，RT-PCR方法的檢測以SARS-CoV-2 基因組中開放讀碼框lab（Open reading frame 1ab,ORF-lab）、核殼蛋白（Nucleocapsid, N）基因 和（或）包膜蛋白（Envelop,E）基因等作為檢測靶標。但是病毒存在變異的可能，而這個突變點可能及存在探針上。因此，需要設(shè)置陰性和陽性對照品，目前已見報道有公司申報注冊的試劑中，陽性對照包含ORF-1ab基因、N基因、內(nèi)標基因擴增序列的假病毒，可以模擬樣品中病毒核酸的原始狀態(tài)，能夠準確監(jiān)控提取、逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量檢測全過程。
②、采樣方式與時機：
為提高檢出率，對于肺炎患者通常選取下呼吸道標本，從而獲得更高的病毒載量。鼻、咽拭子作為最普遍的采樣方式，其檢出率與病毒感染的進程密切相關(guān)。以甲型流感為例，一般在發(fā)?。玻础罚玻鑳?nèi)，病毒在鼻、咽部的載量達到高峰，隨后迅速下降。由于目前臨床上對SARS-CoV-2感染后鼻、咽部采樣的最佳時機尚無定論，尤其是個別病例潛伏期長，就診時可能已經(jīng)遷延數(shù)天甚至數(shù)周，是否為鼻、咽部采樣的最佳時期，標本內(nèi)病毒載量是否仍在檢測閾值范圍內(nèi)均無法確定，從而造成檢測的“假陰性”。
③、病毒變異可能：
考慮到SARS-CoV-2屬于不穩(wěn)定、易變異的RNA 病毒，針對其變異頻率及突變熱點等問題暫時難以進行大規(guī)模臨床樣本的驗證，故存在個別病例擴增區(qū)突變而導致“假陰性”的可能。此外，現(xiàn)有核酸檢測試劑盒大多靶向PRF1ab及Ｎ 基因，不同雙位點RT-PCR試劑對于Ｎ基因的擴增靈敏度普遍高于PRF1ab基因，且細胞內(nèi)病毒Ｎ基因ｍRNA 的拷貝數(shù)也遠高于PRF1ab基因；但Ｎ基因的保守程度卻不及PRF1ab基因，推測其為Ｎ基因單靶標陽性比例高于PRF1ab基因的原因。
④、標本保存與運輸：
RNA 病毒穩(wěn)定性差，標本通常須存放在專用保存液中，以４℃或以下溫度保存，并盡快送檢。由于多數(shù)醫(yī)療機構(gòu)在標本采集后需送至各地疾控中心統(tǒng)一檢測，或因檢測單位人力、能力等問題造成個別標本從采樣到實際檢測可能已經(jīng)超過了檢測最佳時限，導致結(jié)果出現(xiàn)“假陰性”。而且保護劑不合適，如保存液導致病毒顆粒沉淀、鹽分太高導致裂解液無法釋放病毒核酸等，也會受影響。
⑤、方法學因素：
RT-PCR檢測的影響因素較多，如標本核酸提取或純化過程出現(xiàn)的擴增反應抑制物、擴增儀孔間溫度差異等。操作對實驗室人員技術(shù)要求較高。不規(guī)范操作可導致核酸提取效率與純度不佳、RNA質(zhì)量良莠不齊，均可導致“假陰性”結(jié)果。
比如操作不當導致核酸降解，而作為RNA病毒的新冠病毒又是單鏈RNA；細胞內(nèi)源RNase或者實驗室空氣氣溶膠里攜帶的RNase等都可能導致降解。
2、核酸檢測“假陽性”原因：
早在2月5日，危重醫(yī)學專家、中國醫(yī)學科學院院長王辰院士在接受央視采訪時說：“并不是所有的病患都能檢測出核酸陽性，對于真實新型冠狀病毒感染的病人，也不過只有30%-50%的陽性率。”
而在采訪李金明教授“2019-nCoV核酸檢測會不會出現(xiàn)’假陽性’？”時，李金明教授說道：“從前面的引物和探針設(shè)計的原理看，從理論上是不應該有假陽性的，并且試劑在批準過程中，也經(jīng)過了分析特異性的性能確認（validation），所以，從方法學上看，是不會有假陽性的。但實際工作中，還是有可能出現(xiàn)檢測的“假陽性”，通常是由于實驗室檢測人員操作時，發(fā)生了標本間交叉污染（cross-contamination）或?qū)嶒炇覕U增產(chǎn)物的遺留污染（carry-over）所致。一個臨床實驗室如果嚴格執(zhí)行’三個陰性樣本隨機放在臨床樣本中間同時參與檢測全過程’的質(zhì)控策略，應可有效避免病毒核酸檢測假陽性結(jié)果的報出，這也是病毒核酸檢測陽性可以作為新冠病毒感染的確診依據(jù)之所在?！?/p>
假陽性，大多是由于樣本污染或者檢測過程中的污染導致。缺少嚴格控制調(diào)價的實驗室環(huán)境、不專業(yè)的檢測操作，以及樣本本身的污染，都會導致假陽性。
①、樣品間交叉污染：
樣本污染主要有收集樣本的容器被污染，或樣本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有樣本造成相互間污染，樣本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導致標本間污染。
②、PCR試劑污染：
主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水以及其他溶液被PCR核酸模板污染。
③、PCR擴增產(chǎn)物污染：
這是PCR種最主要、最常見的污染問題。PCR產(chǎn)物拷貝量大（一般大于1013copy/mL），遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限，所以微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
④、氣溶膠污染：
在空氣與液體面摩擦是就可形成氣溶膠，在操作是比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算，一個氣溶膠顆?？珊?8000個拷貝，因而由其造成的污染是一個特別重視的問題；而有些微生物尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。
⑤、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染：
由于克隆質(zhì)粒在單位容積含量相當高，另外在純化過程中需要較多的用具及試劑，而且在活細胞內(nèi)質(zhì)粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室，這個問題比較常見。
3、討論：
目前，COVID-19 最常用病原學檢查仍然是采用RT-PCR技術(shù)的核酸檢測，臨床上對于核酸檢測為陰性或陽性的病例需謹慎對待，應充分考慮到各環(huán)節(jié)中可能造成結(jié)果不準確的因素。保證試劑盒質(zhì)量、規(guī)范采樣／保存／運輸流程，提高實驗室人員技術(shù)水平、優(yōu)化檢測流程、規(guī)范實驗室設(shè)計及試劑耗材管理 等均可作為提高核酸檢測準確性的有效手段，亦是目前疫情防控工作的關(guān)鍵。
對于實驗過程中產(chǎn)生的“污染”問題，可進行一些以下適當?shù)谋O(jiān)測：
①、陽性對照：
在建立PCR實驗室及一般的檢驗單位都應設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志，陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高(100個拷貝以下），但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大，因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。
②陰性對照：
每次PCR試驗務必做陰性對照，它包括：標本對照，被檢標本是血清就用鑒定后的正常血清做對照，被檢的標本是組織細胞就用相應的組織細胞做對照；試劑對照，在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以檢測試劑是否污染。
③、重復性實驗；
④、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增；
以上就是分析，歡迎各位戰(zhàn)友討論，提出寶貴意見！
參考資料：
1、《新型冠狀病毒實驗室檢查方法的應用現(xiàn)狀及結(jié)果解讀》（吳嘉，汪俊軍，CNKI）；
2、《PCR理論與技術(shù)》第二版（王廷華）；
3、《PCR最新技術(shù)原理、方法及應用》第二版（黃留玉）；
4、《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術(shù)指南》（第五版）；
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