慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是全球重大公共衛(wèi)生問題，除了可導(dǎo)致慢性乙型肝炎，還與肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌等終末期肝病的發(fā)生密切相關(guān)[1]。理想的慢性HBV感染治療終點(diǎn)是獲得“功能性治愈”，其定義為在抗病毒治療結(jié)束后，乙型肝炎表面抗原（HBsAg）持續(xù)消失，HBV DNA檢測陰性，轉(zhuǎn)氨酶水平持續(xù)正常和肝臟組織學(xué)情況的改善[1]。

我國已批準(zhǔn)臨床用于治療HBV感染的藥物主要分為2類，一類是干擾素（interferon，IFN）類，一類為核苷（酸）類似物（nucleoside analogue，NAs）[2]。然而IFN類藥物不良反應(yīng)較大，血清學(xué)轉(zhuǎn)換及治愈率有限[3]，雖然NAs可有效抑制病毒復(fù)制并降低肝臟相關(guān)并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，但單獨(dú)長期使用NAs容易產(chǎn)生耐藥而影響療效，此外其對(duì)HBV抗原抑制性較差，難以實(shí)現(xiàn)HBsAg清除，獲得功能性治愈的概率很?。▋H為0.5%）[4]。因此尋找新的抗HBV治療藥物是當(dāng)前臨床面臨的迫切需要。

板藍(lán)根為十字花科植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥根，性苦、寒，歸心、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血利咽的功效，常用于溫疫時(shí)毒，發(fā)熱咽痛，溫毒發(fā)斑，痄腮，爛喉丹痧，大頭瘟疫，丹毒，癰腫[5]。板藍(lán)根是中醫(yī)臨床上常用的清熱解毒類中藥，主要含有生物堿類、含硫化合物類、苯丙素類等19大類成分[6]。以往研究表明，板藍(lán)根具有抗流感病毒、抗單純皰疹病毒、抗呼吸道合體病毒、抗肝炎病毒、抗內(nèi)毒素、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用[7-8]，尤其抗病毒、抗炎藥效顯著，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[6]。

板藍(lán)根顆粒藥物血清在體外細(xì)胞培養(yǎng)中能使HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞減少分泌HBsAg和乙型肝炎E抗原（HBeAg），作用8 d時(shí)能有效抑制HBeAg的分泌[9]。板藍(lán)根多糖對(duì)HBV有抑制作用，其可能是由于IFN-α依賴性的Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcriptions，STAT）信號(hào)通路的激活和抗HBV蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)[10]。然而板藍(lán)根對(duì)HBV具有抑制作用的具體活性成分及作用機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。

慢性HBV感染時(shí)宿主呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)，激活機(jī)體的固有免疫應(yīng)答是有望實(shí)現(xiàn)HBV功能性治愈的重要治療手段。視黃酸（維甲酸）誘導(dǎo)基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）和Toll樣受體（TLRs）是固有免疫中宿主細(xì)胞識(shí)別HBV的2類重要模式識(shí)別受體[11]，RLRs和TLRs與其配體結(jié)合之后，構(gòu)象發(fā)生改變，從而招募特異的位于細(xì)胞質(zhì)的接頭蛋白，激活信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起I型IFN、促炎癥細(xì)胞因子、趨化因子等一系列抗病毒因子的產(chǎn)生[12]。研究表明，慢性HBV患者的樹突狀細(xì)胞的RIG-I表達(dá)量明顯低于急性HBV患者及健康人RIG-I的表達(dá)量[13]；乙型肝炎病毒X蛋白（HBx）作為去泛素化酶作用于RIG-I通路中的多個(gè)環(huán)節(jié)，使多個(gè)接頭蛋白激活受阻，導(dǎo)致I型IFN產(chǎn)生障礙[14]，提示RIG-I信號(hào)通路的激活對(duì)于HBV治療具有重要意義。

本研究首先在HepG2.2.15細(xì)胞明確板藍(lán)根對(duì)HBV的抑制作用，進(jìn)一步從RIG-I-線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）信號(hào)通路角度探討板藍(lán)根的抗病毒作用機(jī)制，同時(shí)以該信號(hào)通路中的RIG-I、MAVS、IFN調(diào)節(jié)因子7（IRF7）蛋白為靶點(diǎn)，與板藍(lán)根中的活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接，初步篩選板藍(lán)根中調(diào)控該信號(hào)通路的活性化合物，從而明確板藍(lán)根的抗HBV物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。

1 板藍(lán)根在細(xì)胞模型中的抗HBV作用

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，板藍(lán)根在HepG2.2.15細(xì)胞模型中的CC50為5.51 mg/mL，最大安全質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL（圖1-A），板藍(lán)根在給藥后第5天的抗病毒作用最為顯著（圖1-B）。在HepG2.2.15細(xì)胞模型中，板藍(lán)根（1.6 mg/mL）對(duì)HBV DNA、HBeAg、HBsAg的抑制率分別為54.67%、23.29%、66.62%（圖1-C），TDF（200 μg/mL）對(duì)HBV DNA、HBeAg、HBsAg的抑制率分別為95.25%、11.16%、9.26%（圖1-D）。

2 板藍(lán)根對(duì)RIG-I-MAVS信號(hào)通路的調(diào)控作用

通過Western blotting方法對(duì)RIG-I-MAVS信號(hào)通路中各關(guān)鍵蛋白R(shí)IG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7的表達(dá)進(jìn)行檢測，如圖2所示，板藍(lán)根對(duì)RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白的表達(dá)均具有上調(diào)作用，對(duì)RIG-I蛋白的上調(diào)作用較為顯著（P＜0.05、0.001），并且呈劑量相關(guān)性。

3 分子對(duì)接結(jié)果

在PDB數(shù)據(jù)庫中檢索的RIG-I、MAVS、IRF7的PDB格式結(jié)構(gòu)分別為RIG-I（PDB ID：6KYV）、MAVS（PDB ID：2VGQ）、IRF7（PDB ID：3QU3）蛋白，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中共檢索到板藍(lán)根的主要活性成分共169個(gè)，使用Schr?dinger軟件將目標(biāo)靶點(diǎn)與板藍(lán)根主要活性成分對(duì)接后，導(dǎo)出對(duì)接結(jié)果，靶點(diǎn)RIG-I、MAVS、IRF7對(duì)接結(jié)果中結(jié)合能≤?5 kJ/mol的分別有46、83、41個(gè)活性成分。鑒于IRF7是I型IFN的上游因子，IRF7的磷酸化可直接誘導(dǎo)產(chǎn)生具有抗HBV作用的IFN，推測與IRF7結(jié)合能力最強(qiáng)的板藍(lán)根活性成分有較強(qiáng)的抑制HBV作用的潛力。對(duì)接結(jié)果顯示，與IRF7結(jié)合能力最強(qiáng)的是4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛。此活性成分與RIG-I、MAVS也均具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，與RIG-I、MAVS和IRF7的結(jié)合能分別為?5.218、?6.525、?6.813 kJ/mol。

IRF7與4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛的分子結(jié)合模式如圖3所示，化合物4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛與IRF7蛋白兩者間的疏水作用較弱，IRF7蛋白對(duì)4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛不會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的排斥作用（圖3-A），4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛與IRF7蛋白的活性口袋具有較強(qiáng)結(jié)合能力，芳香性較強(qiáng)，且能量分布均衡（圖3-B、C），IRF7蛋白中的賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸與4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛間有π-π鍵結(jié)合、賴氨酸與其以σ-π結(jié)合，此外還有谷氨酸、天冬氨酸與之形成氫鍵作用（圖3-D）。

4 活性成分的抗HBV活性評(píng)價(jià)及機(jī)制探索

本研究通過分子對(duì)接方法初步篩選出潛在抗HBV活性化合物4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛，與板藍(lán)根同樣，基于HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞系HepG2.2.15細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行抗HBV活性評(píng)價(jià)。如圖4所示，4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的CC50＝135.8 μmo/L，最大安全濃度為40 μmol/L，最佳作用時(shí)間與板藍(lán)根同為第5天。在安全濃度下，4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛對(duì)HBV DNA的最大抑制率為33.87%，對(duì)HBeAg、HBsAg的抑制率分別為28.14%、46.14%，陽性對(duì)照藥物TDF對(duì)HBV DNA、HBeAg、HBsAg的最大抑制率分別為93.0%、6.69%、10.55%。

此外，為了比較4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛與板藍(lán)根抗HBV的異同及效率，同時(shí)測定二者與TDF的抗HBV活性。如圖5所示，板藍(lán)根、4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛、TDF對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBV DNA的最大抑制率分別為45.13%、34.6%、94.68%，對(duì)HBeAg的最大抑制率分別為38.39%、21.78%、14.83%，對(duì)HBsAg的最大抑制率分別為73.85%、25.35、22.57%。板藍(lán)根和4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛均可以顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞HBsAg分泌（P＜0.05、0.01、0.001），但4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞HBeAg的分泌無明顯的抑制作用；此外二者均可以顯著抑制HBV DNA的分泌（P＜0.05、0.01、0.001）。

為了驗(yàn)證4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛對(duì)RIG-I-MAVS信號(hào)通路是否具有調(diào)控作用，采用Western blotting方法檢測其處理細(xì)胞5 d后的蛋白樣品中RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白的表達(dá)情況，如圖6所示，4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛可不同程度上調(diào)RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白表達(dá)，對(duì)RIG-I蛋白的上調(diào)作用最為顯著（P＜0.05）。

討論

在HBV生命復(fù)制周期中，HBV前基因組RNA（pre-genomic RNA，pgRNA）由感染肝細(xì)胞核內(nèi)的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。研究顯示，RIG-I可識(shí)別pgRNA并誘導(dǎo)IFN-λ的表達(dá)；此外，RIG-I可依賴以RNA結(jié)合的方式阻止HBV聚合酶P蛋白與pgRNA的5’-ε區(qū)相互作用，從而抑制HBV復(fù)制，基于病毒RNA-RIG-I相互作用的先天防御機(jī)制，其中RIG-I不僅是激活I(lǐng)FN反應(yīng)的HBV傳感器，而且可作為一種直接的抗病毒因子發(fā)揮作用[16]。

在RIG-I通路中，RIG-I首先識(shí)別外源RNA而被激活，然后通過半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（caspase recruitment domain，CARD）與位于線粒體外膜的MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，MAVS被激活后在線粒體上形成朊病毒樣聚集體，募集下游激酶，從而磷酸化IRF7，調(diào)節(jié)IFNs和干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISGs）的表達(dá)。IFN-β可以通過招募STAT1與STAT2與α/β干擾素受體（interferon-α/β receptor，IFNAR）結(jié)合，導(dǎo)致這些分子的二聚、核易位和與IRF9結(jié)合，形成ISG因子3復(fù)合體。然后復(fù)合體結(jié)合到ISG啟動(dòng)子中IFN刺激的響應(yīng)元件上，導(dǎo)致ISG轉(zhuǎn)錄的激活。通過這種方式，IFN-α/β誘導(dǎo)數(shù)百個(gè)ISGs的表達(dá)，其中大量ISGs在細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)[17]。

本研究通過分子對(duì)接的方法，選取機(jī)體固有免疫應(yīng)答RIG-I-MAVS信號(hào)通路中的RIG-I、MAVS、IRF7作為激活誘導(dǎo)I型IFN分泌的抗HBV靶點(diǎn)，篩選了板藍(lán)根中具有潛在抗HBV的活性成分，根據(jù)分子對(duì)接結(jié)果顯示板藍(lán)根中的4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛與RIG-I、MAVS、IRF7蛋白均有較強(qiáng)的相互作用，對(duì)其進(jìn)行抗HBV生物活性驗(yàn)證，同時(shí)對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探索。

板藍(lán)根在HBV穩(wěn)定復(fù)制HepG2.2.15細(xì)胞系上具有抑制HBV DNA、HBsAg、HBeAg作用，4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛在HepG2.2.15細(xì)胞上也可一定程度上抑制HBV DNA、HBeAg、HBsAg的分泌。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，板藍(lán)根和4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛均上調(diào)了RIG-I、MAVS、IRF7、p-IRF7蛋白的表達(dá)。RIG-I作為IFN通路激活表達(dá)的ISG基因，在IFN通路活化后也會(huì)增強(qiáng)表達(dá)，提示板藍(lán)根及其活性成分4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛可能通過直接上調(diào)RIG-I蛋白表達(dá)，同時(shí)間接增加RIG-I等IFN信號(hào)通路分子的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)一步增強(qiáng)IFN信號(hào)通路的活化，執(zhí)行其抗病毒作用。

綜上，本研究通過分子對(duì)接技術(shù)與藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合，首次從RIG-I-MAVS信號(hào)通路的角度闡明了板藍(lán)根的抗病毒作用免疫學(xué)機(jī)制，并初步發(fā)現(xiàn)其抗病毒有效成分4-羥基-1H-吲哚-3-甲醛，為板藍(lán)根的抗病毒臨床應(yīng)用與深入研究提供了參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

參考文獻(xiàn)（略）

來 源：曹夢珍，趙 旭，鄭艷芳，葛斐林，思蘭蘭，李 樂，王伽伯，劉 妍，肖小河．基于分子對(duì)接與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的板藍(lán)根及其活性成分抗乙型肝炎病毒作用機(jī)制研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(7):2127-2134.