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1 成纖維細(xì)胞

成纖維細(xì)胞是最主要的基質(zhì)細(xì)胞，癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)也被稱為活化的成纖維細(xì)胞或肌性成纖維細(xì)胞，其所分泌的基質(zhì)衍生因子-1(SDF-1，又稱CXCL12)可直接刺激CXCR4 腫瘤細(xì)胞生長，還可募集CXCR4 內(nèi)皮前體細(xì)胞(EPCs)參與腫瘤的血管生成。活化的纖維細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4趨化軸吸引CXCR4 腫瘤細(xì)胞做定向遷移。

腫瘤原發(fā)灶所分泌的生長因子刺激“預(yù)轉(zhuǎn)移灶”內(nèi)成纖維細(xì)胞、血小板衍生的生長因子受體陽性(PDGFR )細(xì)胞和纖維連接蛋白增多，為腫瘤細(xì)胞增殖提供環(huán)境。在微轉(zhuǎn)移灶的缺氧環(huán)境中，活化的成纖維細(xì)胞可產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子A (VEGF-A)以促成血管生成，募集來的造血祖細(xì)胞(HPCs)也促進(jìn)血管的生成。

腫瘤細(xì)胞與局部或遠(yuǎn)處成纖維細(xì)胞之間通過旁分泌或內(nèi)分泌而發(fā)生交互作用，腫瘤細(xì)胞通過這種機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境并使遠(yuǎn)處組織發(fā)生顯著改變。癌細(xì)胞分泌的白細(xì)胞介素-1（IL-1）、成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF-2）和PDGF誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分泌肝細(xì)胞生長因子（HGF），HGF與癌細(xì)胞上的c-Met分子結(jié)合后能增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。另外，轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、表皮生長因子（EGF）、胰島素生長因子(IGF)和Wnt1等，是實現(xiàn)瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間“對話”(cross-talk)的旁分泌信使。

2 浸潤的炎癥/免疫細(xì)胞

腫瘤浸潤的炎癥細(xì)胞是一把雙刃劍，除有一定的抗腫瘤作用外，更多情況下是在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在眾多浸潤的炎癥細(xì)胞中，以腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）的研究最為深入廣泛。TAMs可通過分泌 FGF、HGF、EGF、PDGF和TGF-β等多種生長因子促進(jìn)腫瘤生長。

單核細(xì)胞是TAMs的前體細(xì)胞，腫瘤產(chǎn)生的CCL2/MCP-1吸引單核細(xì)胞到腫瘤部位并分化為TAMs。腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和TAMs都能通過產(chǎn)生CCL2、CCL5、CXCL8/IL-8和SDF-1進(jìn)一步募集單核細(xì)胞。另外，CSF-1、VEGF-A和胎盤生長因子(PIGF)等也能引發(fā)單核細(xì)胞向腫瘤組織浸潤。缺氧介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)和VEGF也能吸引TAMs向腫瘤缺氧區(qū)集聚。纖溶酶原片段K1-3能阻斷TAMs的遷移和腫瘤對其募集作用。

TAMs不僅直接或間接地釋放血管生成因子來促進(jìn)血管芽生，而且能夠產(chǎn)生一些酶來參與血管的重建。TAMs是VEGF-A的重要來源之一，還可通過分泌MMP來釋放細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中被結(jié)合的VEGF-A。TAMs受缺氧和CSF-1等因素調(diào)節(jié)，缺氧使HIF-1和HIF-2調(diào)節(jié)的啟動子發(fā)生轉(zhuǎn)錄性活化，上調(diào)VEGF-A、MMPs、白介素和趨化因子。TAMs在破壞基底膜、引發(fā)癌細(xì)胞的遷移方面也發(fā)揮著重要作用。TAMs所分泌的MMP2、MMP9、TGF-β、uPA、tPA和組織蛋白酶等降解膠原、層粘連蛋白和纖維連接蛋白等ECM成分，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

3 未分化的骨髓細(xì)胞

在腫瘤生長的早期，VEGF-A和其他細(xì)胞因子能把骨髓中的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)動員到外周血，使之成為循環(huán)的內(nèi)皮前體細(xì)胞(CEPs)并最終整合到新生血管的管壁上。腫瘤所分泌的生長因子和趨化因子會引起骨髓細(xì)胞增殖和向腫瘤內(nèi)聚集。腫瘤細(xì)胞分泌的VEGF-A和PIGF等能把VEGFR-1 的HPCs和VEGFR-2 的EPCs募集到腫瘤的新生血管部位，促進(jìn)腫瘤的生長和血管生成。

來自骨髓的造血祖細(xì)胞和未成熟的髓系細(xì)胞在SDF-1/CXCR4和CXCL5/CXCR2生物軸作用下被募集到腫瘤侵襲前沿，通過分泌金屬蛋白酶來增強(qiáng)腫瘤的外侵和轉(zhuǎn)移，并能促進(jìn)腫瘤血管和淋巴管生成。CD11b Gr-1 髓系抑制細(xì)胞（MDSCs）通過分泌抑制免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子、上調(diào)NO、產(chǎn)生活性氧族以及增強(qiáng)L精氨酸酶的活性而抑制免疫反應(yīng)，引起腫瘤的免疫逃逸。

近來的研究發(fā)現(xiàn)，造血祖細(xì)胞能為腫瘤細(xì)胞在遠(yuǎn)處的植入和增殖做好準(zhǔn)備，原發(fā)灶所釋放的特殊趨化因子能動員一些未成熟的骨髓來源細(xì)胞(BMDCs)成群地植入到將要發(fā)生轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)處靶器官內(nèi)(圖1-1B)，分泌MMP-9等降解基質(zhì)，使周圍環(huán)境更適合腫瘤的種植和生長。另外，BMDCs也表達(dá)CXCR4，通過與CAFs相互作用而增加SDF-1生成，進(jìn)而吸引CXCR4 腫瘤細(xì)胞。

4 內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和血小板

血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管出芽是血管生成的主要模式。周細(xì)胞在PDGF-B作用下被募集到新生血管周圍，通過加強(qiáng)血管外側(cè)的細(xì)胞間緊密連接以維持血管的穩(wěn)定性。血小板所提供的信號能夠引導(dǎo)BMDCs和瘤細(xì)胞的歸巢與滯留，血小板所釋放的SDF-1在募集和“挽留”CXCR4 的HPCs和EPCs方面起到關(guān)鍵作用，并趨化CXCR4 腫瘤細(xì)胞。穿梭在原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶和骨髓之間的血小板不斷釋放大量的細(xì)胞因子，從而把這些部位連接在一起。

5 趨化因子及其受體與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移

趨化因子是指在多種炎癥和非炎癥狀態(tài)下調(diào)節(jié)白細(xì)胞和其他一些類型細(xì)胞進(jìn)行流動和活化并對這些細(xì)胞具有定向趨化作用的細(xì)胞因子。目前發(fā)現(xiàn)大約50個趨化因子和20個趨化因子受體，根據(jù)N末端兩個半胱氨酸的位置，趨化因子被分為4類：CXC, CC, CX3C 和 C。

在腫瘤的缺氧環(huán)境中，成纖維細(xì)胞分泌的CXCL12(SDF-1)和腫瘤細(xì)胞表達(dá)的CXCR4都增加，從而刺激腫瘤細(xì)胞移動和侵犯。另外，多種趨化因子有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，如CXCL1,CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6,CXCL7, CXCL8等。CXCR2不僅在腫瘤血管形成中扮演重要角色，而且能向腫瘤微環(huán)境中招募巨噬細(xì)胞。

腫瘤細(xì)胞通過趨化因子來募集內(nèi)皮細(xì)胞、顛覆免疫監(jiān)視、操縱免疫細(xì)胞(免疫編輯)并最終導(dǎo)致免疫逃逸，從而促使腫瘤生長和向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞不僅分泌趨化因子，也能對趨化因子作出反應(yīng)。腫瘤轉(zhuǎn)移的靶器官能分泌的大量趨化因子，由于腫瘤細(xì)胞表達(dá)一些趨化因子的受體，在趨化因子軸的作用下，引導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向靶器官轉(zhuǎn)移（腫瘤轉(zhuǎn)移的“信號或歸巢”signaling or homing hypothesis）。CCR7/CCL21軸介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，CCR7/CCL21軸介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向相關(guān)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而CCR10/CCL27生物軸則參與調(diào)節(jié)黑色素瘤的皮膚轉(zhuǎn)移。

6 以腫瘤微環(huán)境為靶點的治療策略

 理論上直接作用于腫瘤細(xì)胞的治療方法有許多不足之處，如腫瘤之間和腫瘤組織內(nèi)部腫瘤細(xì)胞之間的異質(zhì)性，是造成療效差異的主要原因；腫瘤細(xì)胞生物或遺傳特點的不穩(wěn)定性，在疾病進(jìn)展和治療過程中，這種不穩(wěn)定性會不斷增加；目前以腫瘤細(xì)胞為目標(biāo)的治療措施的療效仍有限；在以腫瘤細(xì)胞為靶點的治療過程中常有耐藥的 腫瘤細(xì)胞克隆出現(xiàn)。

而靶向于腫瘤微環(huán)境的治療策略有其自身的的優(yōu)勢，如腫瘤間質(zhì)細(xì)胞具有穩(wěn)定的遺傳背景，不易出現(xiàn)突變和耐藥發(fā)生；腫瘤微環(huán)境的異質(zhì)性更小，療效相對穩(wěn)定，并有可能預(yù)測腫瘤組織對治療的反應(yīng)性；在控制腫瘤轉(zhuǎn)移方面可以發(fā)揮極為重要的作用；化療和放療等多種治療措施對間質(zhì)的作用也是發(fā)揮療效的重要側(cè)面，有時也可 能是最終的作用路徑。

7 靶向作用于腫瘤微環(huán)境的藥物

以腫瘤微環(huán)境中的成分作為新靶點的治療方法能克服許多目前傳統(tǒng)治療方式的限制。針對腫瘤基質(zhì)的靶向治療，由于目標(biāo)的特異性，將不會有太大的毒副作用。不同于腫瘤細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞的基因穩(wěn)定，因此不太可能獲得耐藥性突變。此外，針對腫瘤微環(huán)境中多個成分的靶向治療的聯(lián)合應(yīng)用，可以避免單一靶向時腫瘤通過代償彌 補(bǔ)腫瘤生存所需環(huán)境物質(zhì)。此外，聯(lián)合方案可降低各自的劑量，從而減少治療相關(guān)的毒副作用。此療法的最終目標(biāo)提高治療效果、延長患者生存。

RGD：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid）；TNF：腫瘤壞死因子；VEGF：血管內(nèi)皮生長因子；PDGF：血小板衍生的生長因子；ECM：細(xì)胞外基質(zhì)

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell/tumor-initiating cell, CSC/TIC )是腫瘤細(xì)胞中具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群,其增殖能力明顯強(qiáng)于同一腫瘤組織中的其他癌細(xì)胞, 在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和維持中起十分重要的作用,并且在動物體內(nèi)表現(xiàn)出很強(qiáng)的成瘤能力。Lapidot等人于1994年報道急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)中存在表型為CD34＋CD38－的細(xì)胞亞群, 將其注入非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷型(nonobese diabetic/severe combined immune-deficient, NOD/SCID)小鼠體內(nèi)可誘發(fā)白血病。

Muhammad等人在2003年發(fā)現(xiàn)乳腺癌中也含有能夠在NOD/SCID小鼠中連續(xù)成瘤的干細(xì)胞樣的癌細(xì)胞群體,這是首例關(guān)于腫瘤干細(xì)胞存在于實體瘤中的報道。至目前為止, 人們相繼在多種原發(fā)性腫瘤和癌細(xì)胞系中鑒定到腫瘤干細(xì)胞的存在。已發(fā)現(xiàn)有腫瘤干細(xì)胞存在的腫瘤種類。腫瘤干細(xì)胞與增殖力較弱的非干細(xì)胞樣腫瘤細(xì)胞相比表現(xiàn)出更強(qiáng)的形成腫瘤的能力。O'Brien等人從結(jié)腸癌中篩選到含有腫瘤干細(xì)胞的CD133 細(xì)胞亞群, 在NOD/SCID小鼠成瘤實驗中顯示出與CD133-細(xì)胞亞群在成瘤能力上的明顯差異。1×103個CD133 細(xì)胞足以在小鼠體內(nèi)形成腫瘤, 且成瘤率高達(dá)100％, 而CD133-細(xì)胞的注射量達(dá)到2.5×105時, 僅得到11％的成瘤小鼠。

此外,與腫瘤細(xì)胞相比, 腫瘤干細(xì)胞在放化療中表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性, 這與腫瘤干細(xì)胞能更有效的啟動DNA應(yīng)急反應(yīng)和高表達(dá)耐藥相關(guān)蛋白有關(guān)。腫瘤干細(xì)胞的高成瘤率和對放化療的抵抗能力,使其在放化療過程中得以存活, 導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。因此, 有效的清除腫瘤干細(xì)胞對于獲得理想的抗癌療效十分必要。

各種腫瘤類型中腫瘤干細(xì)胞的分子標(biāo)記（或分選方法）

（*） 少數(shù)樣品腫瘤干細(xì)胞為CD133陰性, （**）待證實

載體直接影響治療作用的發(fā)揮, 因此選擇合適的載體對于取得理想的療效很關(guān)鍵。目前, 在靶向腫瘤干細(xì)胞的研究中應(yīng)用最多的載體是小分子抑制劑和融合蛋白。然而,由于靶向性差, 易產(chǎn)生副作用等缺陷, 限制了此類藥劑在臨床治療中的應(yīng)用。大量研究表明, 病毒尤其是溶瘤腺病毒(oncolyticvirus)比小分子類和蛋白類藥物更適合作為靶向腫瘤干細(xì)胞的載體。

以溶瘤腺病毒為載體的病毒基因治療(gene-virotherapy)方案已在實體瘤治療中取得巨大的成功, 將其應(yīng)用于靶向腫瘤干細(xì)胞的治療可望獲得更好的療效。此外,腫瘤干細(xì)胞的特性和內(nèi)部的分子機(jī)制與正常干細(xì)胞很相似。根據(jù)此特點, 人們制定了一系列具有針對性的治療策略,如抑制增殖, 促進(jìn)分化, 誘導(dǎo)凋亡,破壞微環(huán)境(niche)和增強(qiáng)放化療敏感性等。初步實驗結(jié)果表明,這些策略能有效的靶向腫瘤干細(xì)胞并抑制其功能, 達(dá)到理想的治療效果。以下將對靶向腫瘤干細(xì)胞治療載體的選擇以及具體靶向策略等問題作一介紹。

1 靶向腫瘤干細(xì)胞的載體

目前應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞靶向性治療的載體可分為小分子化學(xué)物質(zhì), 蛋白類制劑和病毒。其中, 溶瘤腺病毒同時具有介導(dǎo)外源基因體內(nèi)表達(dá)和直接裂解腫瘤細(xì)胞兩種治療功能,在各種載體中顯現(xiàn)出獨有的優(yōu)勢。

2 小分子和蛋白類藥物

腫瘤干細(xì)胞靶向性治療的研究當(dāng)前主要集中于對特效性化學(xué)小分子類和蛋白類治療藥物的篩選。其中, 小分子藥物具有易于制備, 適合產(chǎn)業(yè)化和無免疫原性等優(yōu)點, 因而在靶向腫瘤干細(xì)胞尤其是白血病干細(xì)胞的研究中涉及較多。Guzman等人發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑MG-132和蒽環(huán)類抗生素idarubicin可以選擇性作用于AML干細(xì)胞, 而對正常造血干細(xì)胞沒有影響。

后來, 該研究小組又篩選出一種倍半萜烯內(nèi)酯Parthenolide藥物, 能夠誘導(dǎo)粒細(xì)胞性白血病(myelogenous leukemia)干細(xì)胞發(fā)生凋亡。最近有報道證實,小分子抑制劑RHPS4和砷均能夠抑制白血病干細(xì)胞的增殖能力。但是小分子藥物副作用明顯,靶向性差, 多次給藥可引發(fā)耐藥性, 這些缺陷大大限制了該類制劑在實際治療中的作用。

將抗體和毒素融合制成的嵌合體－免疫毒素(immunotoxin),可以將起殺傷作用的多肽或蛋白導(dǎo)入表達(dá)相應(yīng)抗原的靶細(xì)胞內(nèi), 對其實行選擇性攻擊,而不影響其他細(xì)胞。已知腫瘤干細(xì)胞存在于有特定表面抗原表型的細(xì)胞亞群中, 這為針對性治療的實施提供了有效靶點。部分腫瘤干細(xì)胞的抗原表型。

目前,已有研究小組研制出對腫瘤干細(xì)胞具有靶向性的immunotoxin。例如,Du等人將CD123抗體與假單胞菌外毒素A重組構(gòu)成immunotoxin, 體外實驗表明該融合蛋白能有效的靶向AML白血病干細(xì)胞。Feuring-Buske等人利用IL-3與白喉毒素的融合蛋白殺滅AML干細(xì)胞, 效果顯著且不會影響正常造血干細(xì)胞。雖然含有特異性抗體的融合蛋白與小分子相比,靶向性得到很大提高, 但免疫原性強(qiáng)和生產(chǎn)成本高仍是其需要克服的缺點。

3 病毒載體

與使用小分子類和蛋白類藥物的治療方案相比, 以病毒為載體的基因療法(gene therapy)則表現(xiàn)出許多明顯的優(yōu)勢：(ⅰ)能夠介導(dǎo)外源基因高效的進(jìn)入細(xì)胞并長期表達(dá);(ⅱ)某些種類的病毒對腫瘤細(xì)胞有天然的靶向性, 經(jīng)改造后, 靶向性和安全性顯著提高;(ⅲ)不易使機(jī)體產(chǎn)生耐藥性。Clement等人使用慢病毒為載體介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi), 顯著抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的SHH通路活性, 削弱了CD133＋細(xì)胞在NOD/SCID小鼠體內(nèi)的成瘤能力, 有效的靶向了腫瘤干細(xì)胞群體。其中, 慢病毒能維持治療基因長期表達(dá)的優(yōu)勢在實驗中得到體現(xiàn)。

目前, 用于腫瘤基因治療的病毒類載體類型很多。其中, 逆轉(zhuǎn)錄病毒最早被用于基因治療,其特點是僅整合分裂期細(xì)胞。Ho等人在檢測MCM的mRNA表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)大部分的腫瘤干細(xì)胞處于G0期。而且也另有文獻(xiàn)指出腫瘤干細(xì)胞分裂不活躍。所以, 盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒對腫瘤中分裂旺盛的細(xì)胞特異性很強(qiáng),但并不是靶向腫瘤干細(xì)胞的理想載體。慢病毒克服了逆轉(zhuǎn)錄病毒對靜止期細(xì)胞不能整合的缺點, 還能夠介導(dǎo)外源基因長期表達(dá)。但是其產(chǎn)量過低, 即便是第一代慢病毒的產(chǎn)量也不過108-109pfu/mL, 而現(xiàn)在應(yīng)用最廣的第三代慢病毒的滴度只有106pfu/mL, 不能滿足實際治療對病毒量的需求。

腺相關(guān)病毒雖然具有易于操作, 安全性較好,組織特異性靶向等優(yōu)點, 但其可插入片段的最大長度只有4.7kb,不能同時攜帶多個基因, 所以其在靶向腫瘤干細(xì)胞治療中的應(yīng)用受到一定限制。痘病毒和單純皰疹病毒也分別由于免疫原性強(qiáng)和可轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類有限而不適合作為靶向腫瘤干細(xì)胞的載體。

改造后的腺病毒是使用非常廣泛的一種腫瘤治療載體, 其相關(guān)研究比較深入, 可插入的基因片斷容量大(上限至38kb), 可感染的細(xì)胞類型多, 轉(zhuǎn)染效果好, 包裝滴度非常高(1011-1012pfu/mL), 能夠同時轉(zhuǎn)染分裂期和非分裂期的細(xì)胞, 安全性較好,同其他類型的病毒載體相比, 更適宜成為靶向腫瘤干細(xì)胞的載體。不過,包括腺病毒在內(nèi)的病毒類載體大都為復(fù)制缺陷型, 其復(fù)制和感染過程中的關(guān)鍵基因已被敲除或突變。經(jīng)過這種改造的病毒不能在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制,僅能發(fā)揮介導(dǎo)基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的載體功能, 治療潛能的發(fā)揮受到很大限制。

4 新型靶向腫瘤干細(xì)胞載體－溶瘤腺病毒

除了通過介導(dǎo)治療基因的表達(dá)來抑制腫瘤的發(fā)展外, 病毒還能夠通過自身的復(fù)制直接裂解腫瘤細(xì)胞。1997年, Heise等人改造了腺病毒的E1B區(qū), 使55kD蛋白缺失, 使之選擇性的在p53異常的腫瘤細(xì)胞中增殖,治療效果讓人振奮, 這就是世界上第一個構(gòu)建成功的溶瘤腺病毒。

實驗室的溶瘤腺病毒載體ZD55也是基于上述原理構(gòu)建的。該類復(fù)制型腺病毒能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量增殖, 最終致使癌細(xì)胞裂解而引起瘤體的消退。另外,溶瘤病毒還可以通過誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)來增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的局部抗腫瘤作用。為了避免溶瘤腺病毒對正常組織產(chǎn)生毒副作用,使其復(fù)制能力局限于腫瘤細(xì)胞, 人們進(jìn)行了大量的改造工作, 采用修改病毒自身基因或使用腫瘤特異性啟動子調(diào)控病毒復(fù)制相關(guān)基因表達(dá)的策略構(gòu)建了多種能安全性較高的腫瘤特異性溶瘤腺病毒。

最近, Jiang等人通過實驗發(fā)現(xiàn), 溶瘤腺病毒Delta-24-RGD能夠有效的清除腦癌干細(xì)胞。這是首例以溶瘤腺病毒為治療載體成功殺傷腫瘤干細(xì)胞的報道, 表明了將其應(yīng)用于靶向腫瘤干細(xì)胞治療的有效性。更重要的是,腫瘤干細(xì)胞中人端粒酶(hTERT)的活性明顯高于正常干細(xì)胞, 而我們自行構(gòu)建的溶瘤腺病毒載體CHNK300和Ad-TERT使用hTERT啟動子調(diào)控病毒復(fù)制中起關(guān)鍵作用的E1A蛋白, 能夠選擇性的在hTERT轉(zhuǎn)錄活躍的腫瘤干細(xì)胞中復(fù)制而不影響正常干細(xì)胞,在殺傷腫瘤干細(xì)胞的同時又能有效降低毒副作用的產(chǎn)生, 作為靶向腫瘤干細(xì)胞的載體非常理想。

病毒基因治療策略結(jié)合了基因療法和病毒療法兩種治療方案的優(yōu)點, 使用溶瘤腺病毒為治療載體, 介導(dǎo)外源基因進(jìn)入癌細(xì)胞并使之有效表達(dá)。該策略不僅可以依靠增殖型病毒的溶瘤作用來直接殺傷癌細(xì)胞,還能使攜帶的治療基因拷貝數(shù)隨病毒復(fù)制而大量擴(kuò)增, 顯著提升外源基因的治療效果。將構(gòu)建的攜帶鼠源內(nèi)皮抑制素(mouse endostatin, mE)的溶瘤腺病毒CHNK300注射到小鼠體內(nèi)誘發(fā)的腫瘤中,28天后, 腫瘤體積消減至770mm3, 而注射了攜載mE的復(fù)制缺陷性腺病毒的對照組瘤體僅減小至1400mm3。

大量的證據(jù)表明, 以溶瘤腺病毒為載體的病毒基因治療策略表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景,其治療的效果明顯好于單獨采用溶瘤策略或傳統(tǒng)基因治療策略所達(dá)到的療效, 是最有發(fā)展前途的腫瘤基因治療方案之一。若使溶瘤腺病毒攜帶針對腫瘤干細(xì)胞的治療基因,應(yīng)用于靶向腫瘤干細(xì)胞的治療, 可望取得令人滿意的療效。

5 針對腫瘤干細(xì)胞的治療策略

為了限制腫瘤干細(xì)胞在腫瘤發(fā)生和維持中的功能, 取得更為理想的治療效果, 研究人員采取了多種行之有效的針對性策略。如抑制增殖,促進(jìn)分化, 誘導(dǎo)凋亡, 破壞niche和增強(qiáng)放化療敏感性等。

（1）削弱增殖能力

WNT, SHH和Notch等細(xì)胞信號通路以及人端粒酶(hTERT)不僅調(diào)控干細(xì)胞的自我增殖, 而且在生物體的發(fā)育, 成體后組織的恒態(tài)維持(homeostasis)中起關(guān)鍵作用, 其異常可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。最近的研究表明, 腫瘤干細(xì)胞功能的維持同樣依賴這些通路。因此, 抑制上述信號通路和hTERT的活性將對腫瘤干細(xì)胞自身功能的維持產(chǎn)生很大影響, 從而削弱其增殖能力。

Fan等人用阻礙Notch通路的γ分泌酶抑制劑處理成神經(jīng)管細(xì)胞瘤, 明顯削弱了CD133 腫瘤細(xì)胞的增殖力, 但對CD133-的腫瘤細(xì)胞分裂沒有影響。Verma等人利用RNAi技術(shù), 下調(diào)結(jié)腸癌WNT通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá), 數(shù)據(jù)顯示, 被處理的細(xì)胞在軟瓊脂上形成克隆的比率和在裸鼠體內(nèi)成瘤的能力明顯下降,表明腫瘤干細(xì)胞的增殖能力被有效抑制。Phatak等人使用小分子藥物RHPS4選擇性抑制白血病干細(xì)胞的端粒酶催化亞基(hTERC), 減弱了其在核內(nèi)的活性,結(jié)果造成白血病干細(xì)胞增殖能力明顯下降。

另外, 胚胎干細(xì)胞增殖和全能性維持所需的Oct3/4、Nanog和Sox2因子等, 對腫瘤干細(xì)胞發(fā)揮功能也起到重要作用,提示這些因子也可以作為腫瘤干細(xì)胞的靶點, 用以削弱其增殖能力。

（2）促進(jìn)分化

腫瘤可以視為異常發(fā)育的器官。與正常器官發(fā)育的不同之處在于, 腫瘤組織中的干細(xì)胞往往分化異常, 表現(xiàn)為分化過程受阻。因此, 誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞重新分化, 使其喪失分裂潛能, 同樣可以到達(dá)抑制腫瘤的發(fā)展的目的。

全反式維甲酸(all-transretinoic, ATRA)最早被用于腫瘤的促分化治療, 在對急性早幼粒細(xì)胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia, APL)的治療中表現(xiàn)出良好的療效。Bergmann等人使用組蛋白去乙?；傅囊种苿㏒AHA處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7, 可觀察到明顯的細(xì)胞分化特征。另外, 化療藥物Cannabinoid也被證實具有誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分化和抑制腫瘤發(fā)展的作用。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogen protein, BMP)是一類在多種組織發(fā)育中起作用的細(xì)胞因子。其中BMP4對神經(jīng)組織的發(fā)育和神經(jīng)干細(xì)胞的正常有序分化發(fā)揮重要功能。最近,Piccirillo等人用外源的BMP蛋白誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞發(fā)生分化,結(jié)果導(dǎo)致整個腫瘤群體的成瘤能力被嚴(yán)重削弱。

（3）破壞微環(huán)境

成體組織中的干細(xì)胞均處于niche中。Niche為干細(xì)胞提供養(yǎng)分和保護(hù), 使之免受外來物質(zhì)的毒害,協(xié)助其維持自我增殖能力, 調(diào)控其分化進(jìn)程。因此, 破壞niche會嚴(yán)重影響干細(xì)胞的正常功能, 甚至?xí)?dǎo)致死亡。已有證據(jù)證明腫瘤干細(xì)胞也處于niche中以維持其自我更新能力和特性。破壞腫瘤干細(xì)胞所依賴的niche,會嚴(yán)重影響腫瘤干細(xì)胞數(shù)量和功能的維持。

Calabrese等人證實腦癌的腫瘤干細(xì)胞位于內(nèi)皮細(xì)胞附近的區(qū)域,脫離該區(qū)域會影響腫瘤干細(xì)胞的增殖能力。此外, 在小鼠腦內(nèi)成瘤實驗中,與人內(nèi)皮細(xì)胞共注射的腦癌干細(xì)胞的增殖能力明顯強(qiáng)于單獨注射的腦癌干細(xì)胞, 表明破壞腫瘤干細(xì)胞niche會嚴(yán)重影響其功能的維持。AML干細(xì)胞為維持其增殖能力必須進(jìn)入位于骨髓的niche中, 細(xì)胞表面的跨膜蛋白CD44, 在其向骨髓遷移的過程中起重要作用。Jin等人用CD44的單克隆抗體H90阻斷CD44與其功能受體的結(jié)合, 以阻礙AML干細(xì)胞向niche轉(zhuǎn)移, 結(jié)果大大抑制了其增殖和成瘤的能力。

（4）誘導(dǎo)凋亡

目前, 通過誘導(dǎo)凋亡程序的啟動消滅腫瘤細(xì)胞的策略已經(jīng)被廣泛采納。該策略可以通過兩種途徑實現(xiàn): 促進(jìn)促凋亡通路的活性和抑制抗凋亡通路的功能。研究表明,參與這兩種通路的蛋白種類繁多。其中較為常見的促凋亡蛋白包括: p53, TRAIL, caspase3,GranzymeA/B, Bid, Bax和Fas等; 重要的抗凋亡蛋白包括: Bcl-2, Bcl-xL, survivin和XIAP等。通過載體介導(dǎo)外源促凋亡蛋白的表達(dá), 或使用RNAi技術(shù)抑制抗調(diào)亡蛋白的翻譯, 是目前常用的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的手段。

Zhang等人使用溶瘤腺病毒ONYX-411攜帶能沉默突變型K-ras的siRNA轉(zhuǎn)染特定癌細(xì)胞,能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。如果更進(jìn)一步, 不是僅僅通過單個途徑,而是在表達(dá)促凋亡蛋白的同時抑制抗凋亡通路的活性, 則能更有效的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Pei等人使用溶瘤腺病毒ZD55介導(dǎo)Smac和TRAIL在肝癌細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá), 在抑制抗凋亡蛋白表達(dá)的同時促進(jìn)凋亡通路的活性, 與單獨使用Smac或TRAIL相比,能更好的殺死腫瘤細(xì)胞。

Lebedeva等人將白介素-24(IL-24)和一段能沉默突變型K-ras基因的反義RNA(K-ras AS)同時插入復(fù)制缺陷型腺病毒中構(gòu)建成攜帶雙基因的載體, 經(jīng)實驗證明比只攜帶IL-24或K-ras AS的腺病毒有更強(qiáng)的誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡的能力。我們可以采用同樣的策略,選用對腫瘤干細(xì)胞有靶向性的病毒載體, 同時攜帶雙基因, 誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序, 直接清除該細(xì)胞群體。

（5）增加對放療和化療的敏感性

放療和化療是當(dāng)前腫瘤治療的常規(guī)手段。但是在連續(xù)多次治療后, 腫瘤容易產(chǎn)生抗藥性, 致使療效欠佳。另外, 放化療后腫瘤的復(fù)發(fā)也是臨床治療中的常見問題。一般而言, 放療主要影響的是分裂期細(xì)胞而對非分裂期細(xì)胞作用不明顯。然而,腫瘤干細(xì)胞分裂緩慢, 多處于非分裂期, 因此對放療的反應(yīng)不敏感。放療結(jié)束后, 腫瘤干細(xì)胞重新增殖直接導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)。

Bao等人經(jīng)研究 發(fā)現(xiàn), 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與非干細(xì)胞樣膠質(zhì)瘤細(xì)胞相比, 能更有效的啟動DNA損傷檢驗點反應(yīng), 減少射線對其造成的傷害。在實驗中,他們又通過抑制檢驗點激酶Chk1和Chk2的活性, 成功的削弱了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞對射線產(chǎn)生傷害的抵抗能力, 恢復(fù)了其對射線的敏感性。

另一方面, 腫瘤干細(xì)胞對化學(xué)藥物的多藥抗藥性(multi drug resistance, MDR)與BCRP1、MGMT, 抗凋亡蛋白和MDR相關(guān)蛋白的高表達(dá)有密切關(guān)系。通過抑制這些抗性相關(guān)蛋白的表達(dá),可以增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞對藥物的敏感性, 提高其在化療中的死亡率。可見,通過消除腫瘤干細(xì)胞對射線和藥物的抗性這一策略, 仍然能夠依靠放化療這些傳統(tǒng)的治療手段來有效的清除腫瘤干細(xì)胞。

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靶向腫瘤代謝的策略

1、腫瘤無氧糖酵解途徑的異常和調(diào)節(jié)，PKM2為關(guān)鍵分子

腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)主要依賴于無氧糖酵解，而丙酮酸激酶（PK）是這一過程中的限速酶，有兩個異構(gòu)體，分別為PK-M1和PK-M2，其中前者較后者有更高的活性。然而，既往研究顯示，腫瘤細(xì)胞中活性較低的PK-M2呈高表達(dá)，而非活性較高的PK-M1。

美國學(xué)者孔（Kung）等通過采用PK-M2的異構(gòu)激活劑AGX-257作用于多種腫瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)PK-M2的活性提高后腫瘤生長受到抑制；而通過對AGX-257作用前后進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，活性低的PK-M2無法將糖酵解途徑中的中間體全部轉(zhuǎn)化為丙酮酸，導(dǎo)致這些中間體合成絲氨酸進(jìn)入氨基酸代謝途徑，從而促進(jìn)了腫瘤的生長。PK-M2激活劑可以作為腫瘤聯(lián)合治療的一部分。本研究不僅解釋了腫瘤選擇性高表達(dá)活性低PK的原因，更為重要的是，還為腫瘤的靶向治療提供了新的治療策略。

2、線粒體功能異常的調(diào)控作用。

線粒體是正常細(xì)胞的主要供能單位，而腫瘤細(xì)胞即使在有氧的條件下也以無氧糖酵解為主要的獲能方式（即Warburg效應(yīng)）。另外，腫瘤細(xì)胞中的線粒體數(shù)量并沒有明顯減少，提示腫瘤細(xì)胞的線粒體功能是異常的。國立衛(wèi)生研究院（NIH）在內(nèi)的一個聯(lián)合研究團(tuán)隊，通過建立不同背景的線粒體和細(xì)胞核融合模型，發(fā)現(xiàn)功能異常的線粒體具有促進(jìn)細(xì)胞生長和克隆形成的能力，而正常細(xì)胞的線粒體則不具備這一功能。

來自美國霍華德-休斯醫(yī)學(xué)研究所的肖（Shaw）等發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的功能異常線粒體存在自嗜障礙，其主要的調(diào)節(jié)因子是ULK1（一種絲/蘇氨酸蛋白激酶），ULK1上調(diào)可促進(jìn)線粒體的自嗜，而ULK1的上游調(diào)節(jié)因子是LKB1。有趣的是，在非小細(xì)胞肺癌中，LKB1的突變率高達(dá)30%，且常與KRAS突變并存。研究者通過建立LKB1缺陷動物模型進(jìn)行藥物篩選，發(fā)現(xiàn)一種線粒體復(fù)合體Ⅰ的抑制劑phenformin對LKB1缺陷及突變型腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。此外，該研究團(tuán)隊還進(jìn)一步構(gòu)建了LKB1和KRAS雙突變模型，發(fā)現(xiàn)phenformin同樣有效，且可以逆轉(zhuǎn)RAS-MEK抑制劑的耐藥。清除腫瘤細(xì)胞的線粒體可能成為靶向治療的新手段，其中靶向突變型的LKB1可能成為肺癌新的治療手段。

3、中間體及其代謝物的調(diào)節(jié)作用

腫瘤細(xì)胞長期處于應(yīng)激的微環(huán)境中，在代謝過程中會產(chǎn)生一系列活性氧簇（ROS），包括O2-、H2O2、HO2、OH等。ROS具有雙向調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡和增殖的作用，中、高濃度的ROS可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和死亡，而低濃度ROS能夠影響一系列信號傳導(dǎo)途徑，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，但其中的機(jī)制尚不明確。美國芝加哥大學(xué)海（Hay）等發(fā)現(xiàn)，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是調(diào)整ROS濃度的關(guān)鍵點。提示檢測并調(diào)整NADPH的濃度，有可能成為新的抗腫瘤治療手段。

腫瘤代謝途徑異常主要是由于兩方面原因。第一，表達(dá)代謝途徑中限速酶的基因突變或擴(kuò)增，如膠質(zhì)瘤和急性白血病中IDH1和IDH2基因出現(xiàn)突變，遺傳性副神經(jīng)節(jié)瘤中SDH基因功能缺失性突變，腎癌中FH基因功能缺失突變導(dǎo)致HIF-1α的穩(wěn)定，以及黑色素瘤和乳腺癌中PHGDH的擴(kuò)增和過表達(dá)。第二，控制代謝途徑的癌基因和抑癌基因出現(xiàn)變異，例如PI3K/AKT/mTOR和AMPK的活化可以增加葡萄糖攝取、脂質(zhì)合成及抑制自嗜，p53活化可誘導(dǎo)自嗜并增強(qiáng)線粒體的代謝功能，myc擴(kuò)增或過表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞對谷氨酸的利用等。

因此，阻斷代謝途徑中的關(guān)鍵限速酶或者干預(yù)其上游的癌基因或抑癌基因均可在一定程度上抑制腫瘤的發(fā)展。目前在臨床應(yīng)用中，單一信號通路的靶向治療效果常不理想，旁路途徑的激活是重要原因之一。而克服旁路激活導(dǎo)致的耐藥，目前多采用橫向聯(lián)合多條信號通路抑制劑的方式。由于各條信號通路最終會通過調(diào)控下游的代謝來影響細(xì)胞行為，因此縱向聯(lián)合信號通路和代謝途徑抑制劑亦可能產(chǎn)生增強(qiáng)的抗腫瘤效果。然而，代謝途徑中存在不同的代謝通路，不同類型或不同狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞可能依賴于不同的代謝通路，因此發(fā)現(xiàn)腫瘤特異的代謝通路及其中的關(guān)鍵限速酶就成為腫瘤代謝學(xué)的重點和難點。

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針對端粒末端轉(zhuǎn)移酶的靶向治療

端粒末端轉(zhuǎn)移酶和端粒在細(xì)胞衰老或永生化過程中起決定性的作用。端粒末端轉(zhuǎn)移酶活性的再活化與腫瘤的生長有關(guān)，是惡性腫瘤共有的一個特征。因此，一些臨床前及臨床研究證據(jù)認(rèn)為端粒末端轉(zhuǎn)移酶有望成為腫瘤治療的新靶點。最近，Marian 等用端粒末端轉(zhuǎn)移酶抑制劑 GRN163L 靶向惡性膠質(zhì)瘤（glioblastoma， GBM）干細(xì)胞，體外及體內(nèi)實驗均顯示出良好的治療效果。

GRN163L 能夠使 GBM 干細(xì)胞端?？s短、降低增殖率，導(dǎo)致干細(xì)胞死亡。GRN163L 與替莫唑胺及放射治療聯(lián)合應(yīng)用能夠發(fā)揮協(xié)同作用，更有效地抑制 GBM 干細(xì)胞的生長。發(fā)揮協(xié)同作用的機(jī)制：一方面，在端粒末端轉(zhuǎn)移酶缺失的情況下，射線和替莫唑胺導(dǎo)致的 DNA 斷裂不能被修復(fù)；另一方面，替莫唑胺能夠啟動惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自溶作用，而 GRN163L 能夠使該作用進(jìn)一步加強(qiáng)。此外，GRN163L 能夠通過血-腦脊液屏障，克服了常規(guī)抗腫瘤藥物的不足。

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miRNAs與腫瘤靶向治療

miRNAs是真核生物細(xì)胞中固有的一類長度約為22個核苷酸且不編碼蛋白的小分子RNA。miR2NA在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá),通過與mRNA3’端非編碼序列的結(jié)合或降解mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯。miRNAs廣泛參與動植物生命活動的調(diào)控,如生長發(fā)育、營養(yǎng)物質(zhì)的代謝和激素的分泌等。近年的研究表明,其不僅在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,在干細(xì)胞的自我更新和多向分化方面也起著重要作用。用生物信息學(xué)的方法發(fā)現(xiàn),一些調(diào)控干細(xì)胞自我更新的因子,如Notch和PTEN,是miRNAs的靶基因,雖然這些結(jié)果尚待實驗的證實,而且miRNAs調(diào)控干細(xì)胞自我更新的機(jī)制也需進(jìn)一步深入的研究。

Hatfield等發(fā)現(xiàn),在Dicer21(miRNAs生成過程中所必需的一種核糖核酸酶)突變的果蠅GSC細(xì)胞中,大部分細(xì)胞都停滯在細(xì)胞周期G1到S的轉(zhuǎn)變期中,說明干細(xì)胞通過G1/S期轉(zhuǎn)變需要miRNAs的作用,miRNAs在干細(xì)胞自身穩(wěn)態(tài)的維持中發(fā)揮著重要的作用。僅在腫瘤干細(xì)胞中就有大量的miRNA表達(dá)，如下表；

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其它靶點

目前，針對上述多條通路中一些關(guān)鍵分子的抑制劑研究都有不同程度的進(jìn)展。如O6-芐基鳥嘌呤( O6-BG)及其多個衍生物能特異抑制DR通路中O6－烷基鳥嘌啉－DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT），目前正在作為耐藥逆轉(zhuǎn)劑與甲基化劑合用進(jìn)行臨床試驗。還有靶向抑制BER通路中的多聚(ADP-核糖)聚合酶（poly[ADP- ribose]polymerase，PARP）的AG014699、NU1025、AG14361和INO-1001分別處于Ⅰ～Ⅲ期臨床實驗。

這些抑制劑與烷化劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、順鉑或γ－射線聯(lián)合用于腫瘤細(xì)胞或者小鼠移植瘤，能分別增加后者引起的DNA損傷、細(xì)胞生長抑制和荷瘤小鼠的存活時 間。現(xiàn)今，關(guān)注最多的是修復(fù)DSBs的HR和NHEJ通路，分別在這兩條通路中扮演關(guān)鍵角色的ATM和DNA-PK都是PI3K激酶家族成員，前文已經(jīng)提到的wortmannin、LY294002和咖啡因等PI3K家族的廣譜抑制劑都能通過抑制這兩條修復(fù)通路的活性起到放化療增敏的作用。

另外，還有 ATP的競爭抑制劑KU-55933能顯著抑制ATM活性，且作用明顯強(qiáng)于對PI3K家族其它成員的抑制效果，能增強(qiáng)ATM高表達(dá)細(xì)胞株對離子輻射和 VP16、阿霉素、喜樹堿等造成DSBs藥物的敏感性。DNA-PK的選擇性抑制劑IC87361、Nu7026、Vanillin和SU117582也 有相似的作用。

結(jié)

語

多個分子靶向藥物的成功上市為新一代抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了樂觀的前景。但是，必需看到靶向信號通路抑制劑只有在該信號通路高度激活的腫瘤上才產(chǎn)生更好地療效，因此合理的臨床設(shè)計是體現(xiàn)其療效的必要前提。只有在合理的研究策略、全面的臨床前評價和嚴(yán)謹(jǐn)合理的臨床試驗的共同配合下才能開發(fā)出更多有希望的靶點特異性抗腫瘤新藥。