天然產(chǎn)物的化學(xué)變化為產(chǎn)生立體化學(xué)豐富且結(jié)構(gòu)多樣的小分子提供了一種強(qiáng)有力的方法。所得化合物具有不同于大多數(shù)篩選收集物的物理化學(xué)特征，因此是生物研究所需復(fù)雜小分子的極好來源。2019年5月13日，來自University of Illinois的Paul J.Hergenrother研究組在Nature Chemistry發(fā)表題為“Diverse compounds from pleuromutilin lead to a thioredoxin inhibitor and inducer of ferroptosis”的研究論文，發(fā)現(xiàn)新型小分子ferroptocide能夠抑制硫氧還蛋白并誘導(dǎo)鐵死亡。

——對(duì)截短側(cè)耳素的改造——

截短側(cè)耳素具有一個(gè)五元環(huán)，一個(gè)六元環(huán)和一個(gè)八元環(huán)。作者通過一系列縮環(huán)，擴(kuò)環(huán)等反應(yīng)來改變截短側(cè)耳素的環(huán)系統(tǒng)，得到了一組高度復(fù)雜且結(jié)構(gòu)多樣的化合物(圖1)。其中有12種新型結(jié)構(gòu)未被報(bào)道，并且大多數(shù)在大于25mg的規(guī)模下被合成。

圖1 通過改造截短側(cè)耳素的環(huán)系統(tǒng)合成化合物

——抗癌表型篩選和化合物優(yōu)化——

使用卵巢癌細(xì)胞系ES-2測試所得化合物快速殺死癌細(xì)胞的能力，其中化合物P4具有6.7μM的IC50。對(duì)化合物P4進(jìn)行[4+2]環(huán)加成修飾得到更有效的化合物P18（ferroptocide）， IC50為1.6μM。該化合物對(duì)從15名不同轉(zhuǎn)移性癌癥患者的腫瘤組織中新分離的原代癌細(xì)胞也具有強(qiáng)抗癌活性。在P18的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步合成了仍具抗癌活性的帶有炔基的探針P29及熒光探針P30（圖2）。

圖2 Ferroptocide的合成與評(píng)價(jià)

——Ferroptocide誘導(dǎo)鐵死亡而非凋亡——

Ferroptocide能夠快速誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞系的死亡，且死亡速度快于已知最快的促凋亡劑Raptinal，故作者懷疑Ferroptocide并非誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Ferroptocide誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡不能由凋亡抑制劑Q-VD-OPh阻斷，死亡過程中未觀察到PARP-1的降解，也未觀察到凋亡的形態(tài)學(xué)特征（圖3）。

圖3 Ferroptocide誘導(dǎo)快速的非凋亡細(xì)胞死亡

作者發(fā)現(xiàn)ferroptocide誘導(dǎo)細(xì)胞ROS升高，使用C11-BODIPY探針觀察到脂質(zhì)過氧化，并且使用鐵死亡抑制劑ferrostatin-1或DFO預(yù)處理對(duì)ferroptocide誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡具有保護(hù)作用。RNA-seq數(shù)據(jù)也證明了鐵死亡特異性基因(GCLC, GCLM, SLC7A11, CHAC1等)的上調(diào)。然而ferroptocide并未抑制鐵死亡中心調(diào)節(jié)因子GPX4(圖4)。

圖4 Ferroptocide通過鐵死亡殺死癌細(xì)胞

——Ferroptocide共價(jià)修飾硫氧還蛋白——

使用P29帶有炔基的探針進(jìn)行生物素-鏈霉親和素pulldown實(shí)驗(yàn)，得到的結(jié)果中選擇九種蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，GPX4未被鑒定為Ferroptocide的靶標(biāo)。使用siRNA和CRISPR–Cas9最終確定硫氧還蛋白(TXN)為Ferroptocide共價(jià)修飾的蛋白（圖5）。

圖5 Ferroptocide選擇性共價(jià)修飾其靶標(biāo)

硫氧還蛋白具有五個(gè)半胱氨酸(C32, C35, C62, C69, C73)，通過點(diǎn)突變驗(yàn)證了Ferroptocide修飾硫氧還蛋白活性位點(diǎn)半胱氨酸(C32,C35)及相鄰的半胱氨酸(C73) (圖6)。即Ferroptocide影響了硫氧還蛋白活性位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基，抑制其在細(xì)胞中的活性。

圖6 Ferroptocide影響硫氧還蛋白的活性位點(diǎn)半胱氨酸

——Ferroptocide是免疫刺激性化合物——

誘導(dǎo)非凋亡的化合物是有吸引力的抗癌藥物，因?yàn)樗鼈兛赡芤l(fā)免疫反應(yīng)。使用具有免疫活性的(Balb/c)和免疫功能低下(SCID)的4T1三陰性乳腺癌小鼠模型研究Ferroptocide的作用。對(duì)于有免疫活性的Balb/c組，化合物處理比對(duì)照組腫瘤生長減緩40%，而免疫功能低下的SCID組，化合物缺乏活性，表明T細(xì)胞和B細(xì)胞對(duì)Ferroptocide的體內(nèi)活性具有作用(圖7)。

圖7 Ferroptocide調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)

——總結(jié)——

作者對(duì)截短側(cè)耳素的環(huán)系統(tǒng)進(jìn)行改造，得到一系列結(jié)構(gòu)多樣且高度復(fù)雜的化合物，并篩選得到化合物Ferroptocide。Ferroptocide在癌細(xì)胞系及患者原代癌細(xì)胞中快速誘導(dǎo)鐵死亡。Ferroptocide通過抑制硫氧還蛋白(TXN)而非GPX4來誘導(dǎo)鐵死亡。由于其誘導(dǎo)的非凋亡細(xì)胞死亡形式，這類化合物具有與免疫系統(tǒng)協(xié)同治療癌癥的潛力。

參考文獻(xiàn)：

Llabani, Evijola, et al."Diverse compounds from pleuromutilin lead to a thioredoxin inhibitor and inducer of ferroptosis." Nature Chemistry 2019 May 13. 

DOI: 10.1038/s41557-019-0261-6.