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1. 評估AKI

AS IV對CDDP誘導的大鼠AKI有保護作用，與CDDP組相比，其血清肌酐(creatinine, Cr)和血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)水平、體重、食物攝食和組織病理學變化減少。更具體的是，生化分析顯示，與對照組和CDDP+AS IV組相比，CDDP組血清Cr和BUN水平均顯著升高(圖1a和1b)。3組在第5天前體重相近，第8天對照組和CDDP+AS IV組體重相近，但第8天CDDP組體重明顯低于CDDP+AS IV組(圖1c)。與對照組相比，CDDP組的食物消耗量(在CDDP/鹽水注射后2天內(nèi))顯著減少，而CDDP+AS IV聯(lián)合治療改善了這種減少(圖1d)。H＆E染色顯示CDDP誘導的損傷主要集中在腎小管(但不影響腎小球形態(tài))，并伴有炎性細胞浸潤和上皮細胞損傷，腎小管腔增加，蛋白管型和液泡出現(xiàn)，CDDP + AS IV協(xié)同治療可改善這些變化(圖1e)。上述結果表明，AS IV對CDDP誘導的AKI有保護作用，可維持大鼠腎功能。 

圖1 大鼠急性腎損傷(AKI)的評估

(a)血清肌酐水平。(b)血尿素氮的水平。(c)身體重量。(d)食物消費量。(e)腎臟形態(tài)(CDDP組和CDDP+AS IV改善組顯示蛋白管型、上皮細胞損傷、小管腔的形態(tài))。

2. 分析方法的驗證

我們對隨機選取的6個化合物進行保留時間(retention time, RT)、分子量(molecular weight,m/z)和峰強度(peak intensity, PI)在質(zhì)控樣品(quality control, QC)中的重復性評價，以驗證分析方法的性能。表1中的結果表明，基于符合預先定義的接受標準的相對標準偏差(relative standarddeviations, RSD)值，穩(wěn)定性和重復性是足夠的。此外，我們采用主成分分析(principalcomponent analysis, PCA)生成的QC樣本得分圖分布緊密，這些結果表明，該方法在整個研究中按照預期執(zhí)行。

表1 HPLC-TOF/MS對m/z、RT和PI參數(shù)分析方法的驗證

3. 代謝譜的多變量分析

首先，我們用CDDP和AS IV共處理后，覆蓋血清、尿液和腎臟樣本的代表性正、負總離子色譜(TICs)(圖2)，很容易觀察到差異。PCA評分圖(圖3)顯示，無論是正離子模式還是負離子模式，三組之間都存在明顯的分離，這表明我們成功地建立了CDDP誘導的腎毒性模型，并可以利用代謝譜來篩選生物標志物。 

圖2 共處理CDDP和AS IV后，血清、尿液和腎臟樣本的代表性正、負總離子色譜(TICs)

圖3 正和負離子模式下血清、尿液和腎臟樣本的PCA評分圖

4. 鑒定顯著改變的代謝物

PLS-DA評分圖顯示，CDDP和CDDP+AS IV組明顯分離(圖4)。內(nèi)源性代謝物是根據(jù)準確的分子量和MS/MS片段離子鑒定出的顯著改變的候選代謝物(VIP>1和p<0.05)。我們在尿液樣本中鑒定了38種關鍵代謝物，在血清樣本中我們鑒定了20種關鍵代謝物，在腎臟樣本中鑒定了16種具有顯著改變的關鍵代謝物（見表2）。我們還使用熱圖來觀察代謝產(chǎn)物的變化(圖5)，熱圖顯示了血清、尿液和腎臟樣本中代謝產(chǎn)物的上調(diào)和下調(diào)。 

圖4 CDDP和CDDP+AS IV組血清、尿液、腎臟樣品在正和負離子模式下的PLS-DA評分圖

表2 在大鼠血清、尿液和腎臟樣本中鑒定的代謝物信息

圖5 血清、尿液和腎臟樣品中顯著改變代謝物的熱圖

紅色表示上調(diào)的代謝產(chǎn)物，藍色表示下調(diào)的代謝產(chǎn)物。

5. 代謝途徑分析

我們分別使用血清、尿液和腎臟樣品中顯著改變的代謝物在MetaboAnalyst 3.0進行代謝通路分析，使用KEGG數(shù)據(jù)庫識別改變的通路。結果表明，CDDP+AS IV協(xié)同處理可能通過顯著改變血液中的兩條通路(不飽和脂肪酸[UFAs]生物合成及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝)和尿液中的五條通路(苯丙氨酸代謝；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；精氨酸生物合成；精氨酸和脯氨酸代謝；和組氨酸代謝)，以及腎臟中的五種通路(谷胱甘肽代謝；丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；乙醛酸和二羧酸代謝；精氨酸和脯氨酸代謝)(圖6)。代謝通路網(wǎng)絡如圖7所示，顯示了網(wǎng)絡中代謝產(chǎn)物的上調(diào)和下調(diào)。 

圖6 通路影響值與血清、尿液和腎臟樣本相關

每個圓的大小和顏色分別反映了路徑影響值和p值。

圖7 基于AS IV處理CDDP誘導的大鼠AKI后顯著改變的代謝物的代謝途徑改變

紅色表示上調(diào)的代謝產(chǎn)物，藍色表示下調(diào)的代謝產(chǎn)物。

6. 篩選潛在的生物標志物

在對相互間顯著改變的代謝物的分析中，我們鑒定出了尿液樣本中的5個潛在生物標志物和血清樣本中的2個。根據(jù)AUC>0.85進行ROC曲線分析，我們進一步確定了最敏感的生物標志物，因此，血清中的腎上腺酸和尿液中的L-甲硫氨酸和L -組氨酸被確定為AS IV治療效果的潛在生物標志物，每個樣本的離子峰的相對強度反映了實際濃度(圖8)。 

圖8 特征曲線(ROC)分析值和生物標志物的相對水平

盡管CDDP顯示出良好的抗腫瘤活性，但CDDP誘導的AKI的風險限制了CDDP作為化療的使用。因此，為了提高CDDP的效用，預防AKI已經(jīng)成為一個緊迫的課題，并為解決這個問題科學家們做出了許多努力。中藥在中國和東亞其他地區(qū)已經(jīng)使用了數(shù)千年，其在預防和治療化療相關不良反應方面的應用也得到了廣泛的探索，包括CDDP誘導的AKI。

AS IV是黃芪的主要活性化合物之一，具有良好的抗某些疾病活性，包括對多種腎功能障礙的保護作用。其中一個重點是AS IV對CDDP誘導的AKI的保護作用，這是CDDP的主要毒性作用；然而，在代謝通路的相關變化以及生物標志物的鑒定方面研究較少。在本研究中，我們對大鼠血清、尿液和腎臟樣本進行代謝組學分析，以探索AS IV介導的對CDDP誘導的AKI的保護機制，并篩選關鍵的AKI生物標志物。我們鑒定了血清、尿液和腎臟樣本中顯著改變的內(nèi)源性代謝物，我們還鑒定了相關的代謝途徑，如下所述。

1. 氨基酸代謝

5種氨基酸代謝途徑受到AS IV的影響，這些可能是預防CDDP誘導的AKI的關鍵。它們包括丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；苯丙氨酸代謝;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；精氨酸生物合成;精氨酸和脯氨酸代謝；組氨酸代謝。氨基酸是蛋白質(zhì)的主要組成部分，對其他組織功能也很重要。下文討論了氨基酸的改變以及這些改變在AS IV介導的針對CDDP誘導的AKI的保護中的潛在作用。

谷氨酰胺是人體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，具有免疫調(diào)節(jié)等多種功能，包括調(diào)節(jié)巨噬細胞的炎癥反應。炎癥是CDDP誘導AKI的關鍵因素，NF-κB、TNF-α和IL-18上調(diào)；CDDP+AS IV聯(lián)合治療可上調(diào)谷氨酰胺代謝并減少這些炎癥細胞因子的產(chǎn)生。D -谷氨酰胺和D -谷氨酸代謝也發(fā)揮抗氧化作用，防御腎臟自由基損傷和氧化應激；此外，谷氨酰胺和丙氨酸是糖原性氨基酸，當碳水化合物不足時，它們可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖來提供能量。

必需氨基酸精氨酸是尿素循環(huán)中的關鍵化合物，是尿素、肌酸和一氧化氮的前體，主要參與代謝和免疫調(diào)節(jié)。在對炎癥細胞因子的反應中，精氨酸代謝被上調(diào)以合成尿素，肌酸和脯氨酸；精氨酸和脯氨酸的代謝和合成紊亂會顯著影響下游代謝物的產(chǎn)生，例如，腎、肝損傷顯著改變肌酸和肌酐，而肌酸和肌酐水平反映損傷程度。

在CDDP+AS IV的協(xié)同作用下，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成以及苯丙氨酸的代謝均發(fā)生了改變(前者上調(diào)，后者下調(diào))。L-苯丙氨酸是人體內(nèi)一種必需氨基酸，可被苯丙氨酸羥化酶轉(zhuǎn)化為L-酪氨酸，L -酪氨酸與能量代謝和免疫有關，色氨酸與多種保護功能相關，包括調(diào)節(jié)氧化應激、免疫反應和炎癥。

組氨酸代謝通路CDDP+AS IV協(xié)同作用的最后一條通路。組氨酸是哺乳動物的一種必需氨基酸，可與β-丙氨酸結合形成鵝肌肽和肌肽，與清除活性氧(ROS)和保護氧化應激有關。組氨酸可以脫羧成組胺，從而調(diào)節(jié)炎癥和自身免疫。

2.乙醛酸和二羧酸代謝

乙醛酸和二羧酸代謝途徑有助于能量代謝過程中的三羧酸循環(huán)。順烏頭酸是不飽和三羧酸的一種，是檸檬酸的中間體，是三羧酸循環(huán)的主要內(nèi)源性物質(zhì)，是人體能量的重要來源。與對照組相比，CDDP誘導的腎損傷后順式烏頭酸水平降低，而與CDDP+AS IV聯(lián)合治療組相比，順式烏頭酸水平升高，這表明，AS IV可能改善能量代謝，以保護CDDP誘導的AKI。

3.谷胱甘肽代謝

CDDP誘導ROS的形成，而ROS可被腎線粒體中的谷胱甘肽降低，這一過程對減弱AKI至關重要。CDDP使GSH水平降低，抗氧化能力減弱，線粒體氧化應激增加，從而加重腎臟毒性。CDDP+AS IV聯(lián)合治療可減少谷胱甘肽代謝通路的中斷，焦谷氨酸是一種普遍存在的谷氨酸衍生物谷胱甘肽循環(huán)代謝產(chǎn)物，AS IV處理后腎臟中焦谷氨酸和谷氨酸含量增加，暗示GSH循環(huán)的激活有利于CDDP誘導的急性腎損傷的抗氧化應激。

UFAs與調(diào)節(jié)免疫功能有關，包括淋巴細胞增殖。它們也與各種疾病的氧化應激有關，在氧化應激下，多種UFAs(如亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸)可被氧化產(chǎn)生并釋放到血液中，例如，在血液樣本中檢測到對人體健康必不可少的亞麻酸和亞油酸的氧化產(chǎn)物，盡管它們的濃度很低，氧化產(chǎn)物也需被評估；UFAs也能保持膜的流動性，但含量的增加會降低磷脂的打包能力。因此，與單純CDDP治療相比，CDDP+AS IV聯(lián)合治療后血清樣品中幾種UFAs水平較低，可能表明氧化應激降低，細胞膜穩(wěn)定性增強。

綜上所述，AS IV可能通過改善氨基酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝、谷胱甘肽代謝、UFA生物合成等多種代謝途徑來保護CDDP誘導的AKI。這些通路主要與調(diào)節(jié)炎癥反應、減少氧化應激和改善能量代謝有關，這可能是AS IV對CDDP誘導的AKI的保護機制。

AKI的早期治療和評估AKI階段很重要，因為AKI可導致慢性腎臟疾病，甚至增加死亡的風險。許多研究表明，新的生物標志物可能有助于鑒別腎小管損傷患者，而不管其是否表現(xiàn)為明顯的臨床綜合征。血清，尤其是尿液，是很容易獲得的樣本，因此使用這些樣本來識別AKI的生物標志物將是有益的。為了鑒定最敏感的生物標志物，我們鑒定了血清和尿液樣本中各組間顯著改變的代謝物。我們還鑒定了三個敏感的生物標志物，包括血清中的腎上腺酸和尿中的L -組氨酸和L -蛋氨酸，這是基于PCA中確定的三個獨立的組。在兩兩比較中，各組之間的變化是顯著的，CDDP+AS IV組的生物標志物水平在三組中處于中間位置，低于CDDP組，但高于對照組，因此，它們可以反映機體的敏感變化，可能對評估治療效果和早期檢測AKI有幫助。

本研究存在幾個局限性:首先，我們只探索了AKI模型中的代謝組學，對CDDP誘導的慢性腎損傷的影響需要長期研究；其次，需要進一步研究多種劑量和治療時間，以闡明AS IV對CDDP誘導的AKI的漸進影響；第三，將新的生物標志物與早期的生物標志物如腎損傷分子-1(KIM-1)進行比較，我們將進一步進行評估。

綜上所述，我們通過代謝組學研究，探討AS IV對CDDP誘導的大鼠AKI的保護機制和生物標志物。AS IV可通過減少炎癥反應、減少氧化應激和改善能量代謝來保護CDDP誘導的AKI；血清中的腎上腺酸和尿中的L-組氨酸和L-蛋氨酸是敏感的生物標志物，可用于評估預防治療和治療效果。