編譯：草重木雪，編輯：謝衣、江舜堯。
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炎癥性腸病(IBD)是一個全球性的健康問題，腸道菌群失調(diào)在其中起著重要的致病作用。然而，目前用于IBD治療的藥物還遠遠不夠理想。已有研究表明，小白菊內(nèi)酯(PTL)不僅具有抗癌作用，而且具有較強的抗炎作用。本文探討PTL對結腸炎癥的保護作用，揭示其腸道微生物依賴機制。以小鼠體重變化、死亡率、結腸長度、疾病活動度指數(shù)(DAI)評分、H&E染色及結腸鏡檢查評價來評估小鼠結腸炎癥嚴重程度。通過16S rRNA測序和靶向代謝組學分析腸道微生物改變和短鏈脂肪酸(SCFAs)的產(chǎn)生。采用細胞因子芯片和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定結腸細胞因子水平。采用流式細胞術對固有層和脾臟的免疫細胞頻率進行表型分析。發(fā)現(xiàn)經(jīng)小白菊內(nèi)酯處理的小鼠結腸炎癥明顯減輕，體重減輕、存活率降低、結腸長度縮短、DAI評分、組織學評分和結腸鏡檢查評分均降低。值得注意的是，當使用抗生素混合物耗盡腸道微生物群時，PTL對結腸炎癥的保護作用消失。PTL治療下調(diào)促炎細胞因子表達的水平,包括IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-17A和上調(diào)結腸組織免疫抑制細胞因子IL-10。16S rRNA測序顯示，經(jīng)PTL處理的小鼠腸道微生物多樣性和菌群組成明顯豐富。靶向代謝組學分析顯示，PTL治療的小鼠SCFAs生成增加。此外，PTL給藥可選擇性地上調(diào)結腸(Treg)細胞以及下調(diào)結腸輔助T型17(Th17)細胞的比例，提高了Treg/Th17的穩(wěn)態(tài)。通過腸道微生物消耗和糞便微生物移植(FMT)證實了這一腸道微生物依賴機制。從而證明PTL以腸道微生物依賴的方式改善結腸炎癥。其潛在的保護機制與腸道粘膜中Treg/Th17平衡的改善有關，這是通過增加微生物源性SCFAs的產(chǎn)生介導的?？偟膩碚f，該研究證明了PTL作為一種潛在的腸道微生物群調(diào)節(jié)劑在預防和治療IBD中的作用。
論文ID
原名：Parthenolideameliorates colon inflammation through regulating Treg/Th17 balance in a gut microbiota-dependentmanner
譯名：小白菊內(nèi)酯通過腸道菌群調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡改善結腸炎癥
期刊：Theranostics
IF：8.063
發(fā)表時間：2020.04
通訊作者：趙曉晏、楊仕明
通訊作者單位：重慶第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院消化內(nèi)科
實驗設計
在本研究中，首次研究了PTL給藥對結腸炎癥的影響。目的:探討腸道微生物群在PTL的保護中的作用，采用DSS誘導結腸炎、腸道菌群衰竭和糞便菌群移植(FMT)。最后，對腸道微生物依賴的潛在機制進行了探討。
1. DSS誘導急性腸炎
為了誘導急性實驗性結腸炎，小鼠給予1.5-3.0% (w/v)右旋糖酐硫酸鈉DSS在飲用水中添加7天，然后是7天正常水。Parthenolide (PTL) PTL+DSS組小鼠從第0天至第14天腹腔注射(10 mg/kg)鹽水懸液，直至實驗結束。DSS組小鼠腹腔注射生理鹽水作為陰性對照。為避免因注射引起的腹腔感染，嚴格在無菌條件下操作。在所有的結腸炎模型中，每天檢查小鼠的發(fā)病率和體重。每天對每只小鼠的病理特征進行評分，包括糞便粘稠度、血便和體重減輕。結合個體得分產(chǎn)生疾病活動度指數(shù)(DAI)，每只小鼠每日計算一次。根據(jù)參數(shù)分配0-4評分系統(tǒng)，最高分為12分。
2. 組織病理學
取結腸糞內(nèi)容物，沿腸系膜邊緣縱向切開，近端至遠端形成瑞士卷，置于10%中性福爾馬林緩沖液中24h。瑞士卷被轉移到70%的乙醇,然后加工石蠟包埋塊生成5 μm厚的部分用于蘇木精和伊紅染色。切片由經(jīng)驗豐富的病理學家以盲法進行評估，組織學評分基于以下參數(shù):炎癥、上皮缺陷、隱窩萎縮、發(fā)育不良/瘤變、發(fā)育不良影響的區(qū)域。
3. 結腸鏡檢查
使用高分辨率小鼠視頻內(nèi)鏡系統(tǒng)對實驗小鼠進行結腸鏡檢查。用1.5%到2.0%的異氟醚麻醉小鼠，然后用給結腸充空氣使3厘米的近端結腸可視化。根據(jù)以下參數(shù)，對結腸炎的嚴重程度進行盲法評分：結腸半透明(0-3)，纖維蛋白附著于腸壁(0-3)，粘膜顆粒狀外觀(0-3)，血管形態(tài)（0-3），大便特征:正常至腹瀉(0-3)，腔內(nèi)存在血液(0-3)，生成的最大得分為18。
4. 糞便基因組DNA提取和16S-rRNA測序
根據(jù)制造商的方法，利用E.Z.N.A.?土壤DNA試劑盒從0.1 g冷凍糞便樣本中提取糞便基因組DNA。用NanoDrop 2000分光光度計測定DNA濃度和純化。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。擴增文庫覆蓋細菌16S-rDNA的V3-V4高變區(qū)，使用引物341F：5′-ACTCCTACGGGRSGCAGCAG-3′，以及806R: 5′-GGACTACVV GGGTATCTAATC-3′擴增。20μl混合物包含5個4μlFastPfu緩沖區(qū),2μl 2.5 mM dNTPs，0.8μl每個引物(5μM) 0.4μlFastPfu聚合酶以及模板DNA 10ng中進行PCR。PCR初始變性95℃ 3 min，95℃30s27個循環(huán)，55℃退火30 s在72°C時延伸45秒，在72°C時最終延伸持續(xù)10分鐘。反應在熱循環(huán)PCR系統(tǒng)中進行。所有PCR產(chǎn)物均用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒純化以及使用QuantiFluor?-ST進行定量。根據(jù)Majorbio Bio-PharmTechnology Co.的標準方法，純化和匯集擴增子文庫在Illumina MiSeq平臺上配對測序(2×300)。
5. 細胞因子微陣列試驗
結腸外植體培養(yǎng)按以前方法實施。縱向切開的結腸用含2×青霉素-鏈霉素的冰PBS清洗。由于結腸內(nèi)不同區(qū)域結腸炎的嚴重程度存在差異，我們使用3毫米皮膚穿孔工具從相同的遠端結腸區(qū)域生成3至4個明確的圓形活檢樣本進行具體分析。將單個活檢樣本轉移到含有0.5mL無菌細胞培養(yǎng)基的48孔板的孔中，并在37℃的細胞培養(yǎng)箱中孵育15小時。離心收集上清液，除去碎片，根據(jù)制造商方法，使用Luminex Bio-Plex系統(tǒng)評估細胞因子。
6. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
將結腸組織稱重，放入900 mL生理鹽水中，超聲提取后以3000轉/分離心10分鐘，獲得結腸組織勻漿。用ELISA試劑盒按說明書檢測結腸組織勻漿中的細胞因子包括IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-6、TNF-α。捕獲抗體(1:200)附著于4℃板上過夜。阻斷后，樣品室溫孵育2 h，后與檢測抗體(1:200)孵育1 h。隨后加入與辣根過氧化物酶結合的鏈霉親和素，30 min后加入底物。最后，用微平板閱讀器檢測吸光度值。細胞因子濃度按標準曲線計算。
7. 靶向SCFAs定量分析
糞便樣本(10毫克)加入10 μl內(nèi)標(0.0125 μl/μl 2-甲基丁酸)和500μl甲醇，然后按照制造商的方法進行提取。提取的樣品在6890A-5973C GC-MS系統(tǒng)檢測。SCFAs標準品為乙酸鹽、丙酸鹽、丁酸鹽、異丁酸鹽、戊酸鹽和異戊酸鹽的混合物。
8. 糞便微生物移植(FMT)
簡單地說，8-10周齡雄性C57BL/6小鼠接受抗生素雞尾酒療法(萬古霉素，100 mg/kg；硫酸新霉素，200毫克/公斤；甲硝噠唑200毫克/公斤;和氨芐青霉素) 每日一次，共5天，以消耗腸道微生物群。收集PTL+DSS組和DSS組供鼠糞便，用PBS重懸成0.125 g/mL，每天灌胃0.15 mL，連續(xù)灌胃5天。
9. 流式細胞術分析
對于細胞內(nèi)細胞因子IL-10和IL-17A染色，在37°C下5%的二氧化碳條件下首先用離子霉素和PMA刺激單核細胞分離。將GolgiStop蛋白轉運抑制劑加入到細胞懸液后，將細胞在于37°C下5％CO2中再孵育3小時。然后用活/死染料和表面標記物在黑暗中4°C染色30min，然后用固定/滲透工作液和滲透緩沖液在黑暗中常溫固定滲透細胞20min。最后，用抗IL-10或抗IL-17A抗體染色細胞。為了分析轉錄因子Foxp3+的表達百分率，首先用活/死染料和CD45、CD4、CD25表面標記物在黑暗中4°C下對分離的單核細胞進行染色30分鐘。固定/滲透工作溶液以及滲透緩沖液在黑暗中常溫下固定和滲透細胞20 min。最后，用抗Foxp3+抗體染色細胞。
10. 流式細胞術的抗體
抗體包括PerCP標記抗小鼠CD45抗體，亮紫色510標記抗小鼠CD4抗體，PE標記抗小鼠CD25抗體，FITC標記的抗小鼠IL-10抗體，PE標記抗小鼠IL-17A抗體，Alexa Fluor 647標記抗小鼠Foxp3抗體及同型對照，BV421標記小鼠Foxp3抗體及同型對照。
實驗結果
1. PTL治療改善了DSS誘導的結腸炎
2. PTL以腸道微生物依賴的方式減輕結腸炎
雖然IBD的確切病因和發(fā)病機制尚不清楚，但大量證據(jù)表明，腸道菌群改變的失調(diào)反應導致了IBD的發(fā)生使腸道微生物群成為IBD治療的新靶點。為了研究腸道菌群是否參與PTL對于DSS-induced結腸炎的保護作用，在DSS處理前，野生型小鼠灌胃四聯(lián)抗生素混合劑以減少腸道微生物群。由于有報道稱腸道微生物減少的小鼠對DSS的敏感性增強，我們在經(jīng)過抗生素治療的小鼠的飲用水中使用1.5%的低劑量DSS，持續(xù)7天，然后使用正常飲水，再持續(xù)7天(圖2A)。令人驚訝的是，ABX（DSS）組小鼠和ABX（PTL+DSS）組小鼠顯示出難以區(qū)別的體重減輕（圖2B），死亡率（圖2C），結腸長度（圖2E），DAI評分（圖2D），組織學評分（圖 2F）和腸道菌群耗竭后的結腸鏡檢查評分（圖2G）。鏡下典型H&E染色圖像及結腸鏡檢查圖像見圖2F-G。這些結果表明，PTL對結腸炎癥的抗炎保護作用是依賴腸道微生物的。
3. 糞便微生物移植減輕結腸炎
進一步確認PTL-處理鼠減輕結腸炎是否取決于腸道微生物群,我們在腸道菌群耗盡的野生型老鼠(GD WT)進行糞便微生物群(FM)移植實驗，用DSS-處理小鼠(FM (DSS)→GD WT)和PTL-處理鼠(FM (PTL+DSS)→GD WT)的微生物群通過灌胃給藥，每日一次，連續(xù)5天進行重組(圖3A)。為了更好的菌群定殖，實驗小鼠灌胃抗生素雞尾酒，以創(chuàng)造FM前腸道微生物群耗盡條件。相比DSS-處理供體FM移植(FM (DSS)→GD WT)，PTL-處理供體的FM轉移到GD WT宿鼠(FM (PTL+DSS)→GD WT)的結腸炎癥明顯較低,體現(xiàn)在體重減少(圖3B),死亡率(圖3C),和DAI得分(圖3D)都降低,但結腸長度(圖3E)更長。與FM(PTL+DSS)→GD WT的結腸相比，FM (PTL+DSS)→GD WT結腸組織的H&E染色表現(xiàn)出結腸更少的炎癥細胞浸潤，相對更完整的結腸結構，較少黏膜損傷以及較低組織學評分(圖3F)。結腸鏡檢查圖像及結腸鏡檢查評分結果與上述觀察結果一致(圖3G)，這些FMT結果表明，PTL處理小鼠的腸道微生物群對減輕結腸炎癥有作用。
4. PTL處理顯著改變了腸道菌群的多樣性和組成
確定PTL處理是否改變了微生物組，我們對PTL+DSS組和DSS組小鼠糞便細菌DNA中的16S rRNA進行了高通量基因測序分析。我們最初通過不同的方法使用一個廣義線性模型來測量腸道微生物的alpha多樣性。一致地，不同的指數(shù)包括觀察到的分類學單位(OTUs)、Chao、Shannon和Simpson也表現(xiàn)出類似的傾向，并且PTL處理組的體內(nèi)alpha多樣性明顯高于dss處理組(p < 0.05)，每個alpha多樣性指數(shù)分別為p <0.005、p <0.005、p <0.005和p <0.005(圖4A)。為了擴展我們對微生物群落多樣性作用的理解，我們使用Bray-Curtis度量距離、unweight - unifrac距離和Weighted-UniFrac距離算法來生成主坐標分析(PCoA)計算beta多樣性。OTUs之間明顯的聚類分離揭示了兩個群體之間不同的群落結構，表明這兩個群體在組成結構上是不同的（圖4B-D）。
隨后，我們評估了所有可用樣本的腸道微生物區(qū)系，以進一步研究PTL+DSS組與DSS組之間的潛在組成差異。在門水平方面，所有樣本均具有相似的分類學群落，并表現(xiàn)出較高的擬桿菌門和厚壁菌門豐度(補充圖S1A)。擬桿菌門是最主要的門，在PTL+DSS組和DSS組中分別占腸道菌群的64.28%和61.21% (p = 0.80)(補充圖S1B)。厚壁菌門是兩組中第二主要的門，分別占29.45%和28.40% (p = 0.85)(補充圖S1C)。一致地，兩組之間的厚壁菌與擬桿菌的比率（F/B）沒有統(tǒng)計學差異（p> 0.05）（補充圖S1D）。比較了PTL+DSS組與DSS組在類/目/科水平上的分類組成(補充圖S2A-S2C)。在屬水平上，兩組表現(xiàn)出不同的生物組成(補充圖S3A)。對相對豐富>1%的菌屬進行了分析，特別地，Alloprevotella (30.75% vs 4.08%;p< 0.001, q < 0.001) 在PTL+DSS組相對豐度較高，而擬桿菌屬(分別為4.40%和29.58%; p < 0.001、q < 0.001)相對豐度低于DSS組(補充圖S3B)。補充圖S3C-D展示了這兩個組每個樣品的Alloprevotella和Bacteroides的相對豐度。
為了確定PTL治療改變了哪些細菌，進而影響了DSS誘導的結腸炎的疾病進展，我們使用線性判別分析(LDA)效應大小(LEfSe)分析進行高維類比較從而發(fā)現(xiàn)兩組細菌群落優(yōu)勢的顯著差異(圖4E-F)。根據(jù)分析結果，Bacteroidaceae (擬桿菌科和屬)和乳酸菌屬(從桿菌綱到乳酸菌科)是導致DSS組腸道菌群失調(diào)的主要細菌類型。
然而，在PTL+DSS組中，Prevotellaceae (Alloprevotella科和屬)、Rikenella和Fournierella表現(xiàn)出相對富集，這可能與PTL介導減輕結腸炎有關。其中，Alloprevotella屬的LDA得分最高，為5.33 (p=0.0002)，其次為Fournierella評分為4.93 (p=0.0009)。基于屬水平的OTU豐度，我們還組織了兩組之間腸道菌群分析的熱圖比較(圖4G)。同樣，Alloprevotella屬在PTL+DSS組中表現(xiàn)出較高的豐度，而Bacteroides屬在DSS組中顯著富集，這與LEfSe分析結果一致。總的來說，PTL處理顯著改變了腸道菌群的多樣性和組成。
5. PTL處理增加代謝物SCFAs
之前的16S rRNA測序分析顯示PTL+DSS組腸道菌群以Alloprevotella屬、Rikenella屬和Fournierella屬為主，都與SCFAs代謝相關。眾所周知，腸道微生物群代謝產(chǎn)物SCFA在維持腸道動態(tài)平衡中起著關鍵作用，并且在IBD患者以及DSS誘發(fā)的小鼠結腸炎中觀察到SCFA濃度降低。為了研究細菌群落的變化是否對微生物代謝量產(chǎn)生影響，采用靶向代謝組學方法對盲腸內(nèi)容物和糞便樣本中的SCFAs濃度進行評估。與微生物群落結構和組成的變化相一致，PTL+DSS組和DSS組的SCFAs譜完全不同(圖5A)。PTL+DSS組盲腸和糞便中表現(xiàn)出了更高的乙酸鹽(盲腸:p <0.01，糞便:p<0.01)、丙酸鹽(盲腸: p<0.01 &糞便p = 0.03)、異丁酸鹽(盲腸:p<0.01 &糞便p < 0.01)、丁酸鹽(盲腸: p <0.01 &糞便p < 0.01)。雖然異戊酸酯(盲腸:p = 0.04和糞便:p > 0.05)和戊酸酯水平(盲腸:p > 0.05 &糞便:p > 0.05)沒有明顯差異, 但PTL+DSS組盲腸和糞便總SCFAs(盲腸:p < 0.01和糞便:p< 0.01)明顯高于DSS組。
研究PTL給藥腸道微生物群改變后代謝產(chǎn)物SCFAs的產(chǎn)生是否增加，FMT組間也進行了靶向代謝產(chǎn)物SCFAs研究。正如預期的那樣，FM（PTL+DSS）和FM（DSS）組之間的SCFAs產(chǎn)生顯示出與PTL+DSS和DSS組相似的趨勢(圖5 B)。FM(PTL+DSS)組盲腸和糞便樣本的醋酸鹽(盲腸:p<0.01 &糞便:p < 0.01)，丙酸鹽(盲腸:p < 0.01 &糞便:p < 0.01)，異丁酸鹽(盲腸:p < 0.01 &糞便:p)，丁酸鹽(cecum: p < 0.01，糞便:p < 0.01)濃度均顯著高于FM(DSS)組。FM(PTL+DSS)組盲腸和糞便總SCFAs(盲腸:p<0.01&糞便:p<0.01)明顯高于FM(DSS)組?？偟膩碚f，PTL處理調(diào)節(jié)了腸道細菌的群落結構和組成，這與代謝產(chǎn)物SCFAs水平的增加有關。
6. PTL可下調(diào)DSS誘導的結腸炎的促炎細胞因子和上調(diào)抗炎細胞因子
考慮到代謝物SCFAs的抗炎和免疫抑制作用，采用Luminex細胞因子芯片檢測PTL給藥后腸粘膜細胞因子譜的變化?；鹕綀D(圖6A)顯示PTL介導的差異表達細胞因子(DECs)，熱圖顯示前20個DECs (圖6B)。與DSS組相比，PTL+DSS組促炎細胞因子顯著減少,尤其是IL-1β、TNF-α、IL-12、IL-6、IFN-γ、IL-17A、RANTES、IL-1α。相反，PTL+DSS組抗炎細胞因子IL-4和IL-10顯著升高(圖6A-B)。采用ELISA法測定結腸組織20 DECs蛋白水平。其中兩組之間的IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和IL-17A差異顯著(圖6C)，這與細胞因子芯片結果一致。值得注意的是，與DSS組相比，接受PTL治療的小鼠的結腸組織中免疫抑制細胞因子IL-10大約增加了5.52倍。
結腸組織的細胞因子譜也在腸道微生物群消耗組中進行。引人注目的是,促炎細胞因子，包括IL-1β，TNF-α，IL-6，IL-17A，和抗炎細胞因子IL-10表現(xiàn)出類似的水平,ABX (DSS)和ABX (PTL + DSS)組(p> 0.05)沒有顯著區(qū)別(圖6D)。代謝組學結果顯示FMT增加了代謝物SCFAs，因此我們推測FMT也會影響細胞因子的表達。如預期的那樣，與FM（DSS）→GD WT的結腸相比，FM（PTL）→GD WT的結腸組織顯示出較低的IL-1β，TNF-α，IL-6和IL-17A和較高的IL-10蛋白水平（圖6E）。綜上所述，在DSS誘導的結腸炎中，PTL給藥通過下調(diào)促炎細胞因子水平和上調(diào)免疫抑制細胞因子顯著改變了細胞因子譜。
7. PTL通過調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡形成腸道免疫應答
PTL給藥后細胞因子譜發(fā)生明顯改變，免疫抑制細胞因子IL-10和促炎因子IL-17A差異最顯著。腸道黏膜中Treg/Th17平衡在穩(wěn)定腸道微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。為了研究PTL處理對Treg/Th17平衡的影響，采用流式細胞術對結腸固有層T細胞應答進行表型分析。每種細胞類型的相對豐度以總體CD4+T細胞的百分比報告，生成用于生態(tài)分析的群落數(shù)據(jù)矩陣。如補充圖S4示，PTL給藥后Th1(72.64% vs 76.89%;p >0.05)和Th2(6.65% vs 7.10%; p >0.05)細胞反應無顯著差異。然而，對CD4+T細胞間室CD25和Foxp3表達的分析顯示，PTL+DSS組的Treg細胞比例是DSS組的2.67倍(8.06% vs 3.01%；p < 0.05)(圖7A)。與DSS組比較，PTL+DSS組具有較多的Treg細胞(p < 0.05)(補充圖S5A)。由于IL-10是Treg介導的炎癥抑制中關鍵的細胞因子，在以前的細胞因子測量結果中觀察到IL-10在結腸組織中產(chǎn)生的升高(圖6C)，并對IL-10+ Foxp3+細胞的頻率和絕對數(shù)量進行評估。PTL+DSS組結腸LP中分離到的IL-10+Foxp3+細胞比例是DSS組的2.63倍(9.38% vs 3.57%;p < 0.05)(圖7B)，IL-10+ Foxp3+細胞的絕對數(shù)量具有相應趨勢（p <0.05）（補充圖S5B）。然而，對CD4+ T細胞間室IL-17A表達的分析顯示，PTL+DSS組的Th17細胞頻率明顯低于DSS組(1.67% vs 11.32%;p < 0.05)(圖7C)這與PTL給藥后結腸組織中IL-17A濃度的降低是一致的(圖6C)。PTL+DSS組的Th17細胞的絕對數(shù)量明顯低于DSS組(p < 0.05)(補充圖S5C)。為了研究PTL治療是否對全身免疫反應產(chǎn)生影響，對小鼠脾臟Treg細胞(1.09% vs 1.16%;p > 0.05)(圖7A)，IL-10+Foxp3+細胞(1.27% vs 1.25%;p>0.05) (圖7B)和Th17細胞0.05)比例(0.31%對0.31%;p >0.05)(圖7C)也進行了分析。小鼠脾臟中這些T淋巴細胞亞群的絕對數(shù)量在各組間也沒有顯著差異(p > 0.05)(補充圖S5A-5C)。綜上所述，PTL給藥選擇性上調(diào)結腸Treg細胞的頻率，下調(diào)結腸Th17細胞與DSS誘導的結腸炎的比值，改善Treg/Th17平衡，維持腸道穩(wěn)態(tài)。
8. PTL以腸道微生物依賴的方式調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡
進一步研究PTL給藥后Treg/Th17平衡有所改善是否呈腸道菌群依賴性，從腸道菌群缺乏組分離的結腸LP細胞用流式細胞術進行表型分析。ABX(PTL+DSS)組與ABX(DSS)組比較，Treg細胞(1.32% vs1.32%;p > 0.05)(圖8A)，IL-10+ Foxp3+細胞(2.79% vs 2.75%;p > 0.05)(圖8B)和Th17細胞(3.39% vs3.37%;p > 0.05)的百分比差異無統(tǒng)計學意義(p > 0.05)(圖8C)。一致地，這些T淋巴細胞亞群的絕對數(shù)量在腸道菌群消耗組中顯示出了相應的趨勢(p > 0.05)(補充圖S6A)。
同時，FMT組結腸LP中Treg細胞和Th17細胞的頻率和數(shù)量也進行了表型分析。FM(PTL+DSS)組Treg細胞的百分比是FM(DSS)組的3.08倍大(8.07% vs2.62%;p < 0.05)(圖8D)。FM（PTL + DSS）組的Treg細胞絕對數(shù)量高于FM（DSS）組（p <0.05）（補充圖S6B）。實驗結果顯示，FM(PTL+DSS)組中IL-10+ Foxp3+細胞比例較FM (DSS)組高3.04倍(7.82% vs 2.57%;p < 0.05) (圖8E)，這與細胞因子IL-10水平的升高呈現(xiàn)出相應的趨勢(圖6E)。FM(PTL+DSS)組IL-10+ Foxp3+細胞的絕對計數(shù)明顯高于FM(DSS)組(p < 0.05)(補充圖S6B)。相比之下，FM(PTL+DSS)組的Th17細胞比例明顯低于FM(DSS)組(1.75% vs 10.85%;p< 0.05) (圖8F)，各組間Th17細胞絕對計數(shù)趨勢一致(p < 0.05)(補充圖S6B)。這些結果表明PTL給藥后腸道菌群的改變是Treg/Th17腸粘膜平衡改善的原因?？傊?/span>,PTL以腸道微生物依賴的方式調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡。
討論
本研究在體內(nèi)研究了PTL對結腸炎癥的影響。我們的研究結果表明，PTL對DSS誘發(fā)的結腸炎具有顯著的保護作用，表現(xiàn)為體重下降、死亡率、DAI評分、結腸長度縮短、組織學評分和結腸鏡檢查評分都減少。我們還通過腸道菌群耗竭證明了PTL以腸道菌群依賴的方式減輕結腸炎癥。PTL給藥后腸道菌群表現(xiàn)出更豐富的微生物多樣性和菌群組成，有利于SCFAs產(chǎn)生，從而改善腸粘膜Treg/Th17平衡。FMT也被用來證實這種腸道微生物依賴的機制。我們的研究結果表明，PTL是一種很有前途的天然植物提取物，可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物群來預防和治療IBD。
在各種化學誘導結腸炎模型中，DSS誘導結腸炎模型因其簡單和與人類潰瘍性結腸炎有許多相似之處而被廣泛應用。與IBD發(fā)病機制一致，與免疫應答相關的腸道菌群失調(diào)在DSS誘導的結腸炎中有重要作用。因此，DSS誘導的結腸炎是研究針對腸道微生物群紊亂的藥物治療策略的理想模型。通過改變DSS濃度和給藥頻率，可以獲得急性、慢性和復發(fā)的腸道炎癥模型。因此，我們使用3.0%的DSS用于急性炎癥誘導，但當抗生素混合物用于腸道微生物群消耗時，我們將濃度降低到1.5%，以防止抗生素前處理的小鼠對DSS的敏感性增強。PTL被報道在體外具有顯著的抗炎作用，其作用機制包括對NF-κB通路的特異性抑制，還很少報道在體內(nèi)特別是在IBD中的抗炎和抗菌作用。因此，我們首先研究了PTL在體內(nèi)對IBD治療效果。不出所料，PTL給藥后結腸炎癥明顯緩解。不同于常見的炎癥性疾病，腸道菌群失調(diào)在IBD發(fā)病中起著不可或缺的致病作用。在此，有必要研究腸道微生物群是否參與了PTL對結腸炎的保護作用。令人驚訝的是，腸微生物群耗竭后，PTL對結腸炎癥的保護作用消失了，ABX（PTL+DSS）和ABX（DSS）組之間的結腸炎癥嚴重程度沒有顯著差異。隨后,我們執(zhí)行FMT來證實上述觀察。野生型小鼠微生物群經(jīng)PTL處理的小鼠(FM(PTL+DSS)→GD WT)與經(jīng)DSS處理的小鼠(FM(DSS)→GD)重組的相比，結腸炎癥狀及腸道損傷均有減輕。FMT后PTL對結腸炎癥的保護作用出現(xiàn)，FM(PTL+DSS)組與FM(DSS)組結腸炎嚴重程度有顯著性差異。這些結果表明，PTL給藥后腸道菌群的改變是減輕結腸炎癥的原因。值得探索PTL是否與其他文獻表明的通過不依賴腸道菌群的方式體外發(fā)揮抗炎作用,但在IBD它可能是調(diào)節(jié)腸道微生物群掩蓋通過其他信號通路發(fā)揮其抗炎作用。需要設計更深入、更精確的實驗來研究其具體作用機制。
IBD患者腸道微生物組成的生物多樣性減少(稱為失調(diào))，其特征是有益菌群的缺失和致病菌的擴散。將30多種不同的人梭狀芽胞桿菌株移植到無菌小鼠體內(nèi)，導致Treg細胞擴增三倍，而來自相同收集的梭狀芽孢桿菌單一菌株轉移則導致適度Treg應答，提示較大的微生物多樣性可以維持宿主免疫應答的穩(wěn)態(tài)，生物多樣性的減少可能導致IBD的炎癥過程。我們使用16S rRNA測序來研究PTL處理后微生物多樣性和組成的潛在變化?；?/span>OTUs、Chao、Shannon和Simpson等指數(shù)的Alpha多樣性測定結果顯示，經(jīng)PTL處理后的小鼠的微生物區(qū)系多樣性明顯高于經(jīng)DSS處理的。在beta多樣性方面，通過PCoA看出PTL+DSS組小鼠與DSS組小鼠存在明顯的聚類分離，表明PTL處理顯著改變了生物群落結構。為了識別潛在的生物標志物和PTL治療后介導的優(yōu)勢細菌，PTL+DSS組與DSS組進行LEfSe分析。重要的是，3個標志性的細菌分類群，包括Alloprevotella，Rikenella和Fournierella在PTL+DSS組中表現(xiàn)出相對富集，均被描述為有利于腸道菌群代謝物SCFAs的產(chǎn)生。此外，據(jù)報道，在PTL+DSS組中，Alloprevotella屬占主導地位，LDA評分最高，與一生中降低心血管疾病風險相關。因此，我們的觀察表明，PTL給藥通過增加腸道菌群生物多樣性和促進有益菌的相對豐富可以調(diào)節(jié)DSS誘導的結腸炎導致的腸道菌群失調(diào)。
近年來的研究表明，腸道微生物群落組成和細菌代謝產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)炎癥反應可明顯改善IBD預后。特別是，微生物衍生的SCFAs通過其抗炎和免疫抑制功能，在穩(wěn)定腸道免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用?？紤]到PTL+DSS組的優(yōu)勢菌群與SCFAs代謝相關，IBD患者以及DSS誘導的小鼠結腸炎觀察到SCFAs濃度呈下降趨勢，測定了PTL+DSS組和DSS組盲腸內(nèi)容物和糞便樣品中SCFAs的濃度。靶向代謝組學結果顯示，PTL給藥顯著提高了微生物源性SCFAs。此外，FMT還能減輕結腸炎癥和增加微生物源性SCFAs。
既往研究表明，SCFAs可調(diào)節(jié)小鼠結腸Treg池的大小和功能，對DSS誘導的結腸炎具有保護作用。Treg細胞特異性表達轉錄因子Foxp3，通過抑制Th17細胞等其他免疫細胞，分泌抗炎因子IL-10，被認為是多種免疫反應和炎癥的特異性抑制者。此外，PTL給藥通過下調(diào)促炎細胞因子水平和上調(diào)免疫抑制細胞因子水平顯著改變了DSS誘導的結腸炎細胞因子譜。特別是免疫抑制細胞因子IL-10和IL-17A的促炎細胞因子表現(xiàn)出最顯著的差異。Treg/Th17動態(tài)平衡在穩(wěn)定腸道微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中起著不可缺少的作用，可以通過微生物源性SCFAs信號調(diào)控。在我們的研究中，采用流式細胞術研究了結腸固有層T細胞應答。兩組間Th1和Th2細胞反應無明顯差異。正如所料，PTL+DSS組通過PTL介導的代謝產(chǎn)物SCFAs的增加顯著改善了腸道黏膜Treg/Th17平衡，與DSS組相比，表現(xiàn)為Treg細胞和IL-10+Foxp3+ T細胞的頻率增加以及Th17細胞的減少。為了進一步證實腸道黏膜中Treg/Th17平衡的促進作用，我們計算了這些T淋巴細胞亞群的絕對數(shù)量。一致地，PTL+DSS和DSS組之間Treg細胞和Th17細胞的絕對數(shù)量呈現(xiàn)出相應的趨勢。腸道菌群耗盡后，ABX(PTL+DSS)組和ABX(DSS)組Treg細胞和Th17細胞的比值和絕對計數(shù)無顯著性差異。這些數(shù)據(jù)表明，PTL以腸道微生物依賴的方式調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡。另外，GD WT小鼠移植PTL處理的小鼠糞便菌群后，代謝產(chǎn)物SCFAs水平持續(xù)升高。FM(PTL+DSS)組腸道黏膜Treg/Th17平衡的改善可以通過Treg細胞的頻率和數(shù)量增加，而Th17細胞的比例和數(shù)量減少來體現(xiàn)。我們的研究結果表明，PTL給藥后糞便微生物群的改變通過增加代謝產(chǎn)物SCFAs的產(chǎn)生減輕了結腸炎癥，從而改善了IBD發(fā)展Treg/Th17平衡。一些研究人員認為，DSS誘導的急性結腸炎腸道炎癥是由于上皮屏障的損傷和先天免疫反應的激活。因此，我們還分析了慢性結腸炎模型中的T細胞應答(補充圖S7)。值得注意的是，慢性結腸炎模型的T細胞應答也表現(xiàn)出類似的趨勢，這表明PTL給藥在急性和慢性結腸炎模型中的應用是通過腸道黏膜中Treg/Th17平衡的改善介導的。
結論
我們的數(shù)據(jù)表明，PTL以腸道微生物依賴的方式改善結腸炎癥。其潛在的保護機制通過微生物源性SCFAs產(chǎn)生與腸道粘膜中Treg/Th17平衡的改善有關?？偟膩碚f，我們的研究結果證實了PTL作為一種潛在的腸道微生物群調(diào)節(jié)劑在預防和治療結腸炎癥中的作用。然而，盡管PTL是一種很有前途的預防和治療IBD的藥物，但其影響腸道菌群的潛在機制還需要進一步研究。
原文網(wǎng)址：https://www.thno.org/v10p5225.htm
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