癌胚抗原（CEA）是一種具有人類胚胎抗原特性的酸性糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎兒腸組織中，故名癌胚抗原。正常人血清CEA（s-CEA）濃度在5ng/mL以下，CEA升高是一種非特異性腫瘤診斷指標(biāo)，常見于中晚期結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌等；此外長期抽煙的人有可能出現(xiàn)假陽性，因此CEA對腫瘤早期的臨床診斷意義不大，多用于健康體檢及結(jié)腸癌復(fù)發(fā)的輔助診斷。
結(jié)腸癌患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體量大大增加，相應(yīng)的外泌體運(yùn)載的CEA也會增加，也就是說血清中CEA包括游離CEA（s-CEA）、exo-CEA，但是至于兩者各自含量的多少以及對結(jié)腸癌診斷價值高低還不清楚。
近日，日本學(xué)者Shozo Yokoyama等提出一種簡便、靈敏、特異的臨床診斷方法-- ELISA檢測結(jié)腸癌患者血清exo-CEA的含量：發(fā)現(xiàn)“血清復(fù)融溫度、血清外泌體含量、外泌體溶劑成分”等是影響提取exo-CEA產(chǎn)量的關(guān)鍵因素；選取48名發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者，檢測其體內(nèi)的exo-CEA，結(jié)果表明25°C下exo-CEA對診斷具有較高的準(zhǔn)確度，其含量的增加能更有效提示結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性；此外， 臨床檢驗(yàn)科采用的s-CEA的cut-off大約為5ng/mL，而該實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示exo-CEA的cut-off為2 ng/mL，提高其診斷的靈敏度（圖1）。
圖 1 不同cut-off下exo-CEA與s-CEA診斷的靈敏度、特異性、正確度比較
下面，請大家睜大慧眼，跟隨本君來欣賞一下該文獻(xiàn)吧。
首先，本君為大家捋一捋該實(shí)驗(yàn)的思路：該團(tuán)隊(duì)選取116名結(jié)腸癌患者以及8名健康患者；預(yù)實(shí)驗(yàn)：提取8名患者和8名健康者的exo-CEA，探究出提取exo-CEA的最優(yōu)化條件；檢測116名患者exo-CEA，比較s-CEA與exo-CEA的準(zhǔn)確性、靈敏度及特異性。
1. 血清exo-CEA提取實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化
患者血清保存在-20°C，在提取外泌體之前，需在一定溫度下將冷凍血清復(fù)融，然后使用ExoQuick試劑盒提取外泌體，最后使用一定組分的重懸溶劑提取外泌體。在此過程中，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)血清復(fù)融溫度、血清外泌體含量、重懸溶劑成分等是影響exo-CEA產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。
1.1 25°C是最佳血清復(fù)融溫度 （如圖2）
該團(tuán)隊(duì)采用三個溫度復(fù)溶冷凍血清：4°C、25°C、37°C；復(fù)溶溫度對外泌體的提取影響不大（B），但是對exo-CEA的提取影響較大， 25°C是最佳血清復(fù)融溫度（C）；研究者提出假設(shè)：不同溫度會影響exo-CEA的抗原性，但尚需進(jìn)一步的探究。
圖 2
A：CD63是一種外泌體標(biāo)記蛋白，WB實(shí)驗(yàn)測定CD63來反映外泌體的有無；
B：8名患者不同復(fù)溶溫度下血清中外泌體的含量；復(fù)溶溫度對外泌體的提取
C：8名患者不同復(fù)溶溫度下血清中exo-CEA的含量；exo-CEA的提取影響較大，25°C是最佳血清復(fù)融溫度
D：8名健康對照組不同復(fù)溶溫度下血清中exo-CEA的含量；可以排除假陽性干擾
1.2 1%BSA是最適合的重懸溶劑成分（如圖3）
試劑盒提取外泌體最后一步需要使用溶劑將外泌體沉淀重懸，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)1%BSA是最適合的重懸溶劑成分。
圖 3 不同重懸溶劑提取exo-CEA含量比較
2. 25°C下exo-CEA對結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷具有較高的準(zhǔn)確性（如圖4，5）
分析46名患者血清中exo-CEA，比較各個溫度下ROC曲線下面積，25°C下exo-CEA對結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移診斷具有較高的準(zhǔn)確性（圖3）；exo-CEA比s-CEA的臨床診斷準(zhǔn)確度更高（圖4）。
圖 4 不同溫度下exo-CEA的ROC比較
圖 5 exo-CEA與s-CEA的ROC比較
結(jié)語：癌胚抗原（CEA）作為一種經(jīng)典的腫瘤標(biāo)志物已在臨床診斷應(yīng)用許久，其檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法等，本次研究者首次利用ELISA檢測exo-CEA，并對其實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，初步形成一種簡便、靈敏、特異的檢測方法，但是該方法還存在一些疑問：如何提高外泌體及exo-CEA純度，該方法是否適用于其他腫瘤標(biāo)志物的診斷......路漫漫其修遠(yuǎn)兮，吾將上下而求索。
參考文獻(xiàn)：Clinical implications of carcinoembryonic antigen distribution in serum exosomal fraction—Measurement by ELISA. PLOS ONE；August 17, 2017. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0183337
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