作者：苗智慧 劉京生 王燕凌 董蘭鳳 韓彩芝 韓艷青 鄭曉莉 【摘要】  目的 觀察附子酸性多糖對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠免疫功能的影響。方法 采用植物化學(xué)方法得到附子酸性多糖，以灌胃和腹腔注射2種方式給藥，觀察免疫低下小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能，血清溶血素，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 率，自然殺傷細(xì)胞活性以及外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)等多項(xiàng)指標(biāo)，與對(duì)照組比較評(píng)價(jià)附子酸性多糖對(duì)免疫低下小鼠細(xì)胞和體液免疫功能的影響。結(jié)果 附子酸性多糖可顯著提高正常小鼠和免疫低下小鼠的脾臟和胸腺指數(shù)，提高小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能和抗體產(chǎn)生能力，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活 性，并且可以顯著提高白細(xì)胞數(shù)量（P<0.05或P<0.01）。腹腔注射較灌胃給藥的效果更為明顯(P<0.01）。結(jié)論 附子酸性多糖可以顯著提高免疫低下小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能，并可減輕由于環(huán)磷酰胺引起的白細(xì)胞降低，具有減輕化療藥的毒副作用。且不同給藥途徑可影響 其療效。附子酸性多糖具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。 【關(guān)鍵詞】  動(dòng)物,實(shí)驗(yàn);附子；免疫系統(tǒng)；藥物作用; 溶血素類；小鼠     【Abstract】  Objective  To observe the effect of Monkshood acid polysaccharide on immunologic function in immunosuppressive mice. Methods  The acid Monkshood polysaccharide (AMP) was obtained by phytochemistry extraction. The immunosuppressive mice models were made by injecting cyclophosphamide intraperitoneally. The immunosuppressive mice were administrated by gavage and intraperitoneal injection with AMP. The thymus and spleen index, phagocytosis of macrophages, hemolysin, lymphocyte transforming rate,NK cell activity and peripheral-blood WBC were detected and compared with those of model mice to evaluate the effect of acid Monkshood polysaccharide on the humoral and cell immunological function in immunosuppressive mice. Results  AMP could enhance the index of spleen and thymus of immunosuppressive mice,and increase the phagocytic activities of peritoneal-blood macrophage, the ability of antibody forming and lymphocyte transforming rate, and increase the activities of NK and the counts of WBC. There were significant differences between experimental groups and control group (P<0.05 or P<0.01). The effects of intraperitoneal injection was superior to those of gavage administration(P<0.01). Conclusion  AMP could increase humoral and cell immunity function of immunosuppressive mice,moreover, which could relieve the decrease of WBC caused by cyclophosphamide。The results showed that the effects of AMP would be influenced by different administration ways. AMP has broad development and application prospect in clinic.     【Key words】  Animal;Experiment;Monkshood;Immune system;Drug effect; Hemolysin; Mice       近年來研究表明,附子提取液具有強(qiáng)心、抗癌、抗衰老和增強(qiáng)免疫機(jī)能的作用［1］,但關(guān)于附子多糖對(duì)免疫功能低下的機(jī)體的影響至今國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。我們采用 腹腔注射與灌胃給藥2種不同的給藥方法以及不同的給藥劑量系統(tǒng)地研究了附子酸性多糖對(duì)免疫低下小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫功能的影響，以闡明附子酸性多糖對(duì) 機(jī)體免疫功能的作用及可能的影響機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 　　1  材料與方法 　　1.1  實(shí)驗(yàn)材料 　　1.1.1  原料  　　黑附子購(gòu)自石家莊樂仁堂中藥店，由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室聶風(fēng)礻是教授鑒定。 　　1.1.2  試劑  　　無水乙醇、95%乙醇、三氯甲烷（氯仿）均為天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠生產(chǎn)，正丁醇為上海試劑一廠生產(chǎn)，硫酸銨為北京化工廠生產(chǎn)。ConA和MTT為Sigma公司產(chǎn)品。注射用環(huán)磷酰胺(Cy),上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn),批號(hào):061110。 　　1.1.3  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物  　　清潔級(jí)BALB/c小鼠,雌雄各半,體質(zhì)量(18～20)g,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖廠提供，動(dòng)物合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第01-3004號(hào)。 　　1.1.4  實(shí)驗(yàn)儀器  　　CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Forma Scentific）;550酶標(biāo)儀（Bio-Rad）公司; 722分光光度計(jì)（上海第二分析儀器廠），流式細(xì)胞儀（美國(guó)FACS-420），Coulter血液計(jì)數(shù)儀（美國(guó)貝克曼公司）。 　　1.2  方法 　　1.2.1  附子酸性多糖的提取  　　按文獻(xiàn)［2］方法提取附子酸性多糖，以α-萘酚反應(yīng)（Molish反應(yīng)）進(jìn)行鑒定。 　　1.2.2  實(shí)驗(yàn)分組  　　小鼠隨機(jī)分為6組,每組10只。正常對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液0.4 mL/(只·日)；模型對(duì)照組腹腔注射等容積環(huán)磷酰胺100 mg/(kg·日),連續(xù)給藥5日，第6日開始注射0.9%氯化鈉注射液0.4mL/(只·日)；實(shí)驗(yàn)組在模型對(duì)照組的基礎(chǔ)上分高、低2個(gè)劑量并分別以灌 胃和腹腔注射2種方式給藥，高劑量組藥物濃度為20 mg/mL,低劑量組藥物濃度為10 mg/mL,灌胃給藥（po）0.4 mL/（只·日）,腹腔注射給藥(ip)0.4 mL/（只·日），每日1次,連續(xù)15日。 　　1.2.3  小鼠免疫器官質(zhì)量測(cè)定  　　于末次給藥次日，處死小鼠后，稱取胸腺、脾臟質(zhì)量，并計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)。 　　1.2.4  腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能測(cè)定  　　參照文獻(xiàn)［2］方法進(jìn)行，計(jì)算吞噬指數(shù)和吞噬活性。 　　1.2.5  血清溶血素測(cè)定  　　用改良方法［3］檢測(cè)小鼠血清抗體溶血素生成，按下列公式計(jì)算樣品血清溶血素(HC50)：樣品HC50 =樣品的光吸收值/SRBC溶血時(shí)光吸收值×稀釋倍數(shù)。 　　1.2.6  淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測(cè)定  　　用改良的MTT法［3］，最后求出淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)：轉(zhuǎn)化指數(shù)=加ConA孔的OD值/不加ConA孔的OD值。 　　1.2.7  自然殺傷（ NK）細(xì)胞活性檢測(cè)  　　用乳酸脫氫酶釋放法（LDH）檢測(cè)NK細(xì)胞活性［4］，靶細(xì)胞為小鼠脾細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為Yac-1細(xì)胞，效靶比為100∶1。 　　1.2.8  外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)  　　于處死小鼠前從后靜脈叢采血20 μL,用Coulter血液計(jì)數(shù)儀檢測(cè)各組小鼠的白細(xì)胞數(shù)量。 　　1.2.9  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理  　　所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各組間計(jì)量數(shù)值采用兩組間t檢驗(yàn)。 　　2  結(jié)  果 　　2.1  附子酸性多糖對(duì)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響  　　見表1。表1  附子酸性多糖對(duì)小鼠胸腺和脾臟指數(shù)的影響（略）     由表1可見，附子酸性多糖可以提高免疫低下小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），尤其是 腹腔注射組的效果較灌胃組更為明顯(P<0.05，P<0.01)，而高劑量組與低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 　　2.2  附子酸性多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬活性的影響  　　見表2。表2  附子酸性多糖對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬活性的影響（略）     由表2可見，附子酸性多糖可以提高免疫低下小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)和吞噬活性，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05，P<0.01），而高劑量組與低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，相同給藥劑量ip組與op組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P>0.05）。 　　2.3  附子酸性多糖對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)的影響  見表3。表3  附子酸性多糖對(duì)小鼠NK細(xì)胞活性和淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化指數(shù)的影響（略） 　　由表3可見，細(xì)胞免疫功能檢測(cè)表明附子酸性多糖可以促進(jìn)免疫低下小鼠的淋巴細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），而高劑量組與低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 　　2.4  附子酸性多糖對(duì)小鼠血清溶血素和白細(xì)胞數(shù)量的影響  　　見表4。表4  附子酸性多糖對(duì)小鼠血清溶血素和白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響（略）     由表4可見，腹腔注射環(huán)磷酰胺可以導(dǎo)致小鼠白細(xì)胞顯著減少，而附子酸性多糖2種給藥途徑均可提高白細(xì)胞數(shù)量，各給藥組與模型對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.01)。附子酸性多糖可以提高免疫低下小鼠的抗體產(chǎn)生能力(血清溶血素)，酸性多糖組與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.01）,表明其除了提高細(xì)胞免疫功能的作用外，還可以提高機(jī)體的體液免疫水平。 　　3  討  論     附子是毛蔑科烏頭屬(Aeonitum earn1ichad Debx.)植物的側(cè)根,是一種常用的中藥材,具有回陽(yáng)救逆、溫補(bǔ)腎陽(yáng)、祛寒止痛之功效。近年來有文獻(xiàn)提到附子提取液具有強(qiáng)心、抗癌、抗衰老和增強(qiáng)免疫機(jī) 能之功效。我們先前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)附子多糖具有抗腫瘤作用［1］，而其機(jī)制與增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)癌基因的表達(dá)有關(guān)。     實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,附子酸性多糖可以提高環(huán)磷酰胺所致免疫低下小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫各項(xiàng)指標(biāo)，與模型對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01，P＜0.05)。尤其是通過腹腔注射途徑可以得到更好的增強(qiáng)免疫功能的效果，這與我們所做的附子多糖抗腫瘤實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果一致［1］，其 機(jī)制可能是腹腔注射可以更直接進(jìn)入機(jī)體，而口服給藥可能在胃腸道消化吸收過程中對(duì)藥物會(huì)產(chǎn)生一定的影響。實(shí)驗(yàn)表明附子酸性多糖低劑量組與高劑量組提高機(jī)體 細(xì)胞免疫功能的作用無明顯差異，中藥的量效關(guān)系是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，有關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果不盡相同［5］，這一課題值得進(jìn)一步研究。而附子酸性多糖還可以 提高環(huán)磷酰胺造成的白細(xì)胞減少，這一作用對(duì)于應(yīng)用化療治療腫瘤的患者具有重要的意義，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［6］。環(huán)磷酰胺為臨床常用的抗腫 瘤藥物，但在治療過程中，經(jīng)常給患者帶來很多副作用，尤其是對(duì)機(jī)體免疫抑制的副作用，影響了其治療的功效。而附子酸性多糖可以提高環(huán)磷酰胺造成的免疫低下 小鼠的體液免疫和細(xì)胞免疫功能，并提高白細(xì)胞數(shù)量，這為今后臨床用于減輕化療藥的毒副作用，提高患者的免疫功能，特別是增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，對(duì)腫瘤的治 療將起到相得益彰的作用。本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，因此，附子酸性多糖是一種具有廣泛開發(fā)前景的中藥制劑。