九色国产,午夜在线视频,新黄色网址,九九色综合,天天做夜夜做久久做狠狠,天天躁夜夜躁狠狠躁2021a,久久不卡一区二区三区

隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，以及手機(jī)、電腦的普及應(yīng)用，人們用眼時(shí)間不斷延長(zhǎng)，視疲勞已成為目前眼科常見的臨床疾病之一^[1]。視疲勞又稱眼疲勞，主要以視物模糊、不耐久視、干澀不適、酸脹流淚等為臨床表現(xiàn)。中醫(yī)學(xué)將視疲勞稱為肝勞，病因?yàn)檫^用目力、情志內(nèi)傷、外感濕邪、飲食偏嗜，其中以過用目力為最主要因素；病機(jī)以虛為主，虛實(shí)夾雜；常夾郁夾濕，病位以肝、腎、氣為主，證候大致可分為肝腎陰虛、肝腎陰虛夾氣滯、肝腎陰虛夾濕3型，其中以肝腎陰虛最為多見^[2]。

菊花和枸杞子作為清肝明目的著名藥對(duì)，出現(xiàn)在石斛夜光丸、枸菊地黃丸等多個(gè)經(jīng)典方中^[3]。菊花具有清熱解毒、去肝火的功效^[4]；枸杞具有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)肝明目的功效^[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，菊花、枸杞子中含有豐富的多糖、黃酮類、葉黃素等多種活性成分，具有清除自由基、改善眼部不適的作用^[6-11]。山花晶顆粒是在菊花和枸杞子的基礎(chǔ)上增加1味山楂而成，山楂具有調(diào)血脂、抗癌、抗氧化和增強(qiáng)免疫力的藥理作用^[12]，且山楂與枸杞子配伍可以協(xié)同調(diào)血脂和抗氧化^[13]。山花晶顆粒具有滋補(bǔ)肝腎、清肝明目的功效，臨床上主要用于治療肝腎陰虛引起的眼睛干澀、視力模糊、目赤腫痛等視疲勞癥狀，亦可用于高血壓、高血脂癥，但其抗視疲勞的藥效成分及關(guān)鍵作用靶點(diǎn)尚不清楚。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)山花晶顆粒中的活性成分及作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測(cè)，并通過分子對(duì)接方法驗(yàn)證活性成分與靶點(diǎn)的結(jié)合能力，以期為山花晶顆粒的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供依據(jù)。

1  方法

1.1  山花晶顆?；钚猿煞质占鞍悬c(diǎn)篩選

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）^[14-15]，以“菊花”“枸杞子”“山楂”為關(guān)鍵詞，以口服生物利用度≥20%、類藥性≥0.1為篩選條件^[16-17]，并結(jié)合文獻(xiàn)整理菊花、枸杞子和山楂的活性成分，根據(jù)篩選后的化學(xué)成分收集對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)；借助中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析工具（BATMAN，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）^[18]，以“菊花”“枸杞子”“山楂”為關(guān)鍵詞，收集山花晶顆粒中的活性成分，以Targetscore≥20為篩選條件，保留符合條件的活性成分對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)^[19]。

1.2  “中藥-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TCMSP和BATMAN在線數(shù)據(jù)庫篩選藥物作用靶點(diǎn)，借助UniProt（https://www.uniprot.org/）校正靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的基因名，限定物種為人。采用Cytoscape 3.6軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，用Network Analyzer插件分析山花晶顆粒的活性成分和藥物靶點(diǎn)。

1.3  抗視疲勞潛在作用靶點(diǎn)的獲取

由于收集到的疾病靶點(diǎn)與視疲勞的相關(guān)性較差，本研究選擇從藥物靶點(diǎn)出發(fā)，尋找潛在作用靶點(diǎn)。從TCMSP數(shù)據(jù)庫^[20]中篩選出菊花、枸杞子、山楂所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，整合后刪除重復(fù)項(xiàng)，得到TCMSP數(shù)據(jù)庫藥物總靶點(diǎn)；從BATMAN數(shù)據(jù)庫^[21]中篩選出3味藥材對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，整合后刪除重復(fù)項(xiàng)，得到BATMAN數(shù)據(jù)庫藥物總靶點(diǎn)。為避免單個(gè)數(shù)據(jù)庫收載藥物靶點(diǎn)的偏向性，提高與抗視疲勞功效的相關(guān)性，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫中篩選出的藥物總靶點(diǎn)同時(shí)在線導(dǎo)入Venn在線軟件作圖工具平臺(tái)進(jìn)行Venn分析，獲得的交集靶點(diǎn)即為抗視疲勞潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 抗視疲勞潛在作用靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將抗視疲勞潛在作用靶點(diǎn)在線導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/），限定物種為人，得到蛋白與蛋白間的相互作用信息^[22-23]，將獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6軟件，生成PPI網(wǎng)絡(luò)圖。通過CytoNCA插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，分析?nèi)容包括中心性（degreecentrality，DC）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、接近中心性（closenesscentrality，CC）。

1.5  關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)在線導(dǎo)入STRING網(wǎng)站，得到基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析^[24-25]。以P＜0.01為基本標(biāo)準(zhǔn)，按由小到大的順序選擇前20條基因注釋目錄和信號(hào)通路目錄進(jìn)行分析，運(yùn)用R軟件對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

1.6  活性成分與靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的5個(gè)靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，將整理的所有活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行對(duì)接。從TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性成分的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入Sybyl-X 2.0軟件，運(yùn)用Minimize模塊進(jìn)行能量?jī)?yōu)化，獲得穩(wěn)定的分子構(gòu)象，mol2格式輸出保存。通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）^[26]下載靶點(diǎn)的結(jié)晶復(fù)合物，格式選擇pdb，采用Sybyl-X 2.0軟件的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)接模塊進(jìn)行分子對(duì)接，刪除靶點(diǎn)內(nèi)的水分子，添加非極性氫原子，抽取蛋白原配體，以便生成對(duì)接位點(diǎn)空腔進(jìn)行對(duì)接。對(duì)接完成后，根據(jù)低能量和構(gòu)象合理的原則選擇最佳對(duì)接構(gòu)象。

1.7  中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過檢索《中國藥典》2020年版^[27]，獲得山花晶顆粒中山楂、菊花、枸杞子3味中藥的歸經(jīng)，構(gòu)建山花晶顆粒中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1  山花晶顆?；钚猿煞质占鞍悬c(diǎn)篩選

通過數(shù)據(jù)庫檢索以及文獻(xiàn)查閱^[28-31]，共得到66個(gè)活性成分見表1，其中山楂有15個(gè)、菊花36個(gè)、枸杞子24個(gè)，有7個(gè)重復(fù)活性成分，有2個(gè)活性成分存在于3味藥材中。

2.2  “中藥-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

“中藥-活性成分-藥物靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見圖1，包含303個(gè)節(jié)點(diǎn)和1062條邊。通過Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)，BC、CC和DC均較大的活性成分為槲皮素、芹菜素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇，分別對(duì)應(yīng)147、63、60、50、43個(gè)靶點(diǎn)，為網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，表明這些活性成分與靶點(diǎn)的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中起到了關(guān)鍵作用，不同活性成分作用于多個(gè)不同靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)也對(duì)應(yīng)不同活性成分，體現(xiàn)出山花晶顆粒是多成分、多靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)體系。

2.3  作用靶點(diǎn)的Venn分析

將TCMSP和BATMAN數(shù)據(jù)庫中共有的藥物靶點(diǎn)作為潛在作用靶點(diǎn)，即233個(gè)藥物靶點(diǎn)和528個(gè)藥物靶點(diǎn)同時(shí)在線導(dǎo)入Venn在線軟件作圖工具平臺(tái)進(jìn)行Venn分析，獲得交集靶點(diǎn)68個(gè)見圖2，即可能為山花晶顆粒抗視疲勞的潛在作用靶點(diǎn)。

2.4  PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

根據(jù)大于中位數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，選出13個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，對(duì)PPI進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)清晰化，見圖3。越靠近中心區(qū)域的靶點(diǎn)相互作用越強(qiáng)，最內(nèi)圈的多巴胺D2受體（dopamine receptor D2，DRD2）、5-羥色胺受體1A（5-hydroxytryptamine receptor 1A，HTR1A）、膽堿能毒蕈堿受體2（muscarinicacetylcholine receptors，CHRM2）、一氧化氮合成酶3（nitric oxide synthase 3，NOS3）、毒蕈堿型膽堿受體M1（cholinergicreceptor muscarinic 1，CHRM1）、μ-阿片受體（μ-opioid receptor，OPRM1）、腎上腺素能受體α2a（adrenergicreceptor α2a，ADRA2A）、谷氨酸受體2（glutamate receptor 2，GRIA2）、ADRA2C、ADRA2B、γ-氨基丁酸A受體α1（gamma aminobutyric acid A receptorα1，GABRA1）、腎上腺素能受體β2（adrenergic receptor β2，ADRB2）、GABRA2為山花晶顆?？挂暺诘臐撛谧饔冒悬c(diǎn)。

2.5  GO功能及KEGG通路富集分析

將34個(gè)靶點(diǎn)在線導(dǎo)入STRING網(wǎng)站，得到GO和KEGG富集分析數(shù)據(jù)。GO功能注釋包括細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3個(gè)方面，分別得到42、58、437個(gè)目錄，細(xì)胞組分主要涉及質(zhì)膜組成、突觸后膜和γ-氨基丁酸-α受體復(fù)合物；分子功能主要與G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、跨膜信號(hào)受體活性、信號(hào)受體活性、腎上腺素能受體活性等相關(guān)；山花晶顆粒的生物過程主要涉及腺苷酸環(huán)化酶調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、管徑調(diào)節(jié)、血管直徑的調(diào)節(jié)、磷脂酶C激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、血液循環(huán)、系統(tǒng)過程調(diào)節(jié)、腺苷酸環(huán)化酶激活G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路、平滑肌收縮的調(diào)節(jié)。KEGG富集分析有60個(gè)目錄，以P＜0.01為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行富集分析，主要涉及到神經(jīng)活性配體-受體相互作用、鈣信號(hào)通路、環(huán)單磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）信號(hào)通路、環(huán)磷酸鳥苷（cyclicguanosine monophosphate，cGMP）-cGMP依賴性蛋白激酶（cGMP-dependent proteinkinase，PKG）信號(hào)通路、膽堿能突觸、糖尿病并發(fā)癥中的年齡-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advancedglycosylation end-products，RAGE）信號(hào)通路、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)、逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、γ-氨基丁酸能突觸、多巴胺能突觸、缺氧誘導(dǎo)因子-1信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等信號(hào)通路。GO和KEGG前20條目錄見圖4、5。

2.6  分子對(duì)接驗(yàn)證

以靶蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)的原配體作為對(duì)照，將篩選出的所有活性成分與5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（DRD2、HTR1A、CHRM2、NOS3、CHRM1）對(duì)應(yīng)的活性位點(diǎn)（6CM4、5V54、5YC8、1M9J、5CXV）進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見表2。小分子與受體結(jié)合時(shí)的能量越低、構(gòu)象形狀匹配度越高，則對(duì)接打分值越高，表明小分子具有的潛在作用活性越強(qiáng)。3個(gè)小分子對(duì)比原配體，對(duì)接打分值十分接近，表明篩選出的活性成分具有與原配體相當(dāng)?shù)淖饔没钚浴?/span>

選取度值排名靠前的活性成分槲皮素、芹菜素和山柰酚進(jìn)行結(jié)果展示見圖6，槲皮素、芹菜素和山柰酚在DRD2、HTR1A、CHRM2、NOS3和CHRM1靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)內(nèi)的對(duì)接構(gòu)象穩(wěn)定、匹配度良好，均可與靶蛋白形成氫鍵作用，結(jié)合活性良好。

2.7  中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分析

如圖7所示，中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中肝經(jīng)的連接數(shù)為3，其余腎經(jīng)、肺經(jīng)、胃經(jīng)、脾經(jīng)的連接數(shù)均為1，可見山花晶顆粒的主要作用部位在肝。

3  討論

早在2000年前，《黃帝內(nèi)經(jīng)》就論述了肝與目的關(guān)系，其后又得到了歷代醫(yī)家的補(bǔ)充和臨床驗(yàn)證?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》曰：“肝氣通于目，肝和則目能辨五色矣”；明·繆希雍《本草經(jīng)疏·卷二》云：“肝虛十證……目光短屬肝血虛腎水真陰不足”；清·林之翰《四診抉微》亦有云：“眼赤多淚積熱，頭眩不能俯視肝火……羞明怕日，肝腎并見”；由此可見中醫(yī)講眼病從肝治的道理所在。通過中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果可知，山花晶顆粒中3味藥材均入肝經(jīng)，枸杞、菊花滋補(bǔ)肝腎、清熱解毒，山楂健脾消食、酸甘化陰，3藥合用，則可發(fā)揮養(yǎng)肝、瀉火、明目之功效。與臨床上治療肝腎陰虛引起的眼睛干澀、視力模糊、目赤腫痛等視疲勞癥的功效基本吻合。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)山花晶顆粒所含成分及靶點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3味藥材共含66個(gè)活性成分，作用于233個(gè)藥物靶點(diǎn)；其中篩選出34個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用的特點(diǎn)。GO功能及KEGG通路富集分析可知，山花晶顆?？赡芡ㄟ^激活鈣信號(hào)通路和cAMP信號(hào)通路等激活下游磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號(hào)通路，調(diào)控凋亡通路，抑制各種凋亡蛋白，減少細(xì)胞凋亡，并抑制炎性因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）等的產(chǎn)生，減輕眼部細(xì)胞的氧化和損傷，保護(hù)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，與目前研究所證實(shí)的車前子、青葙子、熟地等歸肝經(jīng)中藥發(fā)揮明目功效的作用機(jī)制基本相符^[32-36]。分子對(duì)接結(jié)果表明，來自于山楂、菊花和枸杞子中度值較高的山柰酚、芹菜素和槲皮素3種黃酮成分與關(guān)鍵作用靶點(diǎn)蛋白匹配良好，提示該類化合物可能為核心活性成分群。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法，對(duì)山花晶顆粒的多成分-多靶點(diǎn)與抗視疲勞靶點(diǎn)之間復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行探究及驗(yàn)證，初步闡釋了基于炎性細(xì)胞因子信號(hào)通路發(fā)揮抗視疲勞功效的作用機(jī)制，充分體現(xiàn)了中藥多組分、多靶點(diǎn)、多層次的整體調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為探索抗視疲勞的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供了方向，同時(shí)為山花晶顆粒的進(jìn)一步開發(fā)及應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突  所有作者均聲明不存在利益沖突

參考文獻(xiàn)（略） 

來  源：李  蕊，趙金偉，寧停波，姚景春，梁紅寶．基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法研究山花晶顆?？挂暺诘淖饔脵C(jī)制  [J]. 中草藥, 2021, 52(16):4921-4930 .