在化學(xué)發(fā)光印跡中，獲得的信號(hào)是可變的，通常被認(rèn)為是半定量的。然而，在熒光印跡中獲得的信號(hào)是與熒光團(tuán)結(jié)合的抗體復(fù)合物中靶蛋白的豐度成正比的靜態(tài)值。下表列出了化學(xué)發(fā)光和熒光蛋白印跡之間的主要差異。
化學(xué)發(fā)光檢測(cè)熒光檢測(cè)
工作原理酶標(biāo)二抗 (e.g. HRP 或AP)熒光二抗
檢測(cè)方法膜曝光（常見(jiàn)）
數(shù)字成像（少見(jiàn)）
數(shù)字成像
（激光掃描成像儀）
Multiplexing CapabilityNoYes
敏感性++++++
信號(hào)穩(wěn)定性幾個(gè)小時(shí)幾周到幾個(gè)月
線性動(dòng)態(tài)范圍15倍(薄膜檢測(cè))
3,000-4,000倍(數(shù)字成像儀)
>4,000倍
定量檢測(cè)酶信號(hào)可變，半定量熒光信號(hào)是靜態(tài)的,定量
底物L(fēng)uminol不需底物
如上表所示，熒光蛋白印跡法使用用熒光團(tuán)標(biāo)記的二抗。只有當(dāng)適當(dāng)波長(zhǎng)的光激發(fā)時(shí)，熒光團(tuán)才會(huì)發(fā)光。因此，熒光印跡在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中提供了定量和一致的結(jié)果。然而，可見(jiàn)熒光區(qū)域中相當(dāng)大的膜自發(fā)熒光通常導(dǎo)致較低的信噪比。
此外，通常用于熒光信號(hào)檢測(cè)的電荷耦合器件（CCD）照相機(jī)不能放大弱信號(hào)以檢測(cè)低表達(dá)的蛋白質(zhì)。這兩個(gè)問(wèn)題可能會(huì)限制熒光蛋白印跡的使用。
幸運(yùn)的是，通過(guò)使用具有近紅外（IR）染料的雙色檢測(cè)系統(tǒng)，克服了熒光蛋白印跡中缺乏敏感性的缺點(diǎn)。由于紅外區(qū)域的背景熒光較低，紅外熒光蛋白質(zhì)印跡比使用可見(jiàn)熒光團(tuán)的方案提供高達(dá)200倍的靈敏度。如下所述，這種增加的靈敏度提供了超過(guò)化學(xué)發(fā)光的蛋白質(zhì)印跡的許多重要優(yōu)點(diǎn)。
紅外熒光蛋白印跡的優(yōu)點(diǎn)
1.比化學(xué)發(fā)光更靈敏
紅外熒光印跡已被證明比化學(xué)發(fā)光印跡更敏感. 這是因?yàn)镮R區(qū)域膜上的低背景熒光產(chǎn)生高的信噪比。配備有光電倍增管（PMT）的激光掃描成像儀對(duì)印跡進(jìn)行成像，并可以將弱信號(hào)放大幾個(gè)數(shù)量級(jí)
2.通過(guò)復(fù)用提高量化精度
使用雙色檢測(cè)方法可以同時(shí)檢測(cè)相同印跡上的兩種抗原。例如，您可以分析您感興趣的蛋白，并利用內(nèi)參蛋白（例如GAPDH，肌動(dòng)蛋白）將其均一化，而無(wú)需剝離/重新檢測(cè)印跡或運(yùn)行單獨(dú)的凝膠。因此，您的量化將更準(zhǔn)確。
3.廣泛的線性動(dòng)態(tài)范圍用于定量測(cè)量
為了確保可靠的定量測(cè)量，您從western blot獲得的信號(hào)必須在線性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)。這意味著信號(hào)強(qiáng)度與目標(biāo)蛋白質(zhì)豐度呈線性相關(guān)。換句話說(shuō)，信號(hào)強(qiáng)度的兩倍增加意味著目標(biāo)蛋白質(zhì)水平增加了兩倍。通過(guò)激光成像儀獲得的靜態(tài)熒光值是定量的。這是因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度與幾個(gè)數(shù)量級(jí)的蛋白質(zhì)豐度成正比.這提供了廣泛的線性范圍。您可以在相同設(shè)置下量化低豐度和高豐度蛋白質(zhì)，而不用擔(dān)心信號(hào)飽和或超出線性范圍。
相比之下，X射線膠片的動(dòng)力學(xué)酶 - 底物反應(yīng)和信號(hào)飽和將化學(xué)發(fā)光檢測(cè)的線性度限制在更小的范圍內(nèi)。您經(jīng)常需要嘗試各種曝光以獲得差異表達(dá)蛋白質(zhì)的“正確圖像”。這是為了確保捕獲的信號(hào)在線性范圍內(nèi).
4.一致性和可重復(fù)性
熒光信號(hào)是僅取決于目標(biāo)抗原的量的靜態(tài)值，而許多變量影響通過(guò)膜曝光獲得的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。一些變量（例如，酶底物反應(yīng)）難以控制導(dǎo)致不一致和不可重復(fù)的結(jié)果。 Schutz-geschwender等（2004）報(bào)道了熒光蛋白印跡實(shí)驗(yàn)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。因此，為了確保您的免疫印跡結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。
5.擴(kuò)展信號(hào)持續(xù)時(shí)間
熒光信號(hào)非常穩(wěn)定。您可以將您的印跡存儲(chǔ)在冰箱中，并在您準(zhǔn)備好后再進(jìn)行成像。相比之下，如果您正在進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的免疫印跡，您通常需要馬上開(kāi)始成像。這是為了避免酶活性降低。
期刊編輯和評(píng)論者越來(lái)越普遍要求定量的免疫印跡數(shù)據(jù)。另外，迫切需要提高科學(xué)界的蛋白質(zhì)印跡重現(xiàn)性。正如本文中概述的，IR熒光法相對(duì)于化學(xué)發(fā)光的方法有許多優(yōu)點(diǎn)。它不僅可以節(jié)省您的時(shí)間，而且還為您提供高品質(zhì)，可發(fā)布和翔實(shí)的結(jié)果。還在躊躇猶豫，您不妨從使用如下產(chǎn)品開(kāi)始，開(kāi)啟您的熒光免疫印跡之旅！
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