黃芪建中湯（Huangqi Jianzhong Decoction，HQJZ）為仲景經(jīng)方，出自《金匱要略》，由黃芪、甘草、白芍、桂枝、生姜、大棗和飴糖7味藥組成，具有溫表明，HQJZ對(duì)脾虛引起的各種疾病均有良好的療效[1]，常用于消化系統(tǒng)的腸易激綜合癥、消化性潰瘍、慢性胃炎等疾病[2]。研究證實(shí)HQJZ可通過(guò)干預(yù)細(xì)胞的增殖與凋亡、調(diào)節(jié)破壞因子與保護(hù)因子的平衡、調(diào)節(jié)物質(zhì)能量代謝水平、影響炎癥因子的釋放，提高抗氧化能力等改善慢性萎縮性胃炎癥狀。一氧化氮合酶（NOS）、前列腺素E2（PGE2）、環(huán)
現(xiàn)有研究多局限于針對(duì)某一靶點(diǎn)或某一基因闡釋HQJZ的作用機(jī)制及通路，不能反映中藥多成，通路-疾病”的多層次網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而闡明中藥復(fù)方的作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)分子作用的綜合網(wǎng)絡(luò)分析，最終從整體角度更加透徹地了解中藥與機(jī)體的相互作用。中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（TCMSP）是基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)綜合分析藥效學(xué)、藥動(dòng)學(xué)、靶標(biāo)預(yù)測(cè)以及網(wǎng)絡(luò)、組學(xué)和系統(tǒng)的平臺(tái)[7]，能夠從系統(tǒng)水平識(shí)別藥物靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)和疾病網(wǎng)絡(luò)，揭示中藥性質(zhì)與作用機(jī)制，促進(jìn)中藥發(fā)展與新藥開(kāi)發(fā)[8-9]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路對(duì)HQJZ治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制進(jìn)行全面研究，構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模式，為深入探討其作用機(jī)制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 HQJZ化學(xué)成分信息的收集
通過(guò)TCMSP（http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）以及中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID，http://www. megabionet.org/tcmid/）收集到HQJZ中7味藥的全部化學(xué)成分，并通過(guò)TCMSP、PubChem（https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和Chemical Book（http:// www.chemicalbook.com/）、ChemSpider（http://www. chemspider.com/）以及查閱文獻(xiàn)獲得這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并保存為Smiles格式。
1.2 活性成分的篩選
[10]和[11]是藥物篩選過(guò)程中的2個(gè)重要參數(shù)，常被用作化合物的活性評(píng)價(jià)。利用TCMSP平臺(tái)中的這2個(gè)參數(shù)
1.3 靶點(diǎn)的選擇
Swiss TargetPrediction（http://www.swisstarget-
prediction.ch/）可基于待測(cè)分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)與配體的相似度，通過(guò)交叉驗(yàn)證和分析排列實(shí)現(xiàn)活性分子靶點(diǎn)的準(zhǔn)確預(yù)測(cè)[12]。將篩選得到的潛在活性分子的Smiles結(jié)構(gòu)導(dǎo)入該數(shù)據(jù)庫(kù)，并限定研究物種為人類(lèi)。在靶點(diǎn)預(yù)測(cè)中，3D相似性閾值設(shè)置為0.75，2D相
1.4 “單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
根據(jù)以上預(yù)測(cè)結(jié)果，采用Cytoscape軟件中merge功能構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)模型，節(jié)點(diǎn)（node）代表HQJZ單味藥種類(lèi)、潛在活性成分與潛在作用靶點(diǎn)；邊（edge）用來(lái)連接單位藥與活性成分、活性成分與作用靶點(diǎn)，展現(xiàn)
1.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建
String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/Version10.5）用來(lái)分析已知和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)[13]。將HQJZ活性成分作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，限定研究物種為人類(lèi)，獲得蛋白互作關(guān)系，保存為TSV格式。將該文件中node1、node2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白
1.6 作用靶點(diǎn)類(lèi)型歸屬
DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.disgenet.org/web/ DisGeNET/menu，Version 5.0）是包含與人類(lèi)疾病相關(guān)的基因和變體最完整的數(shù)據(jù)庫(kù)之一，可以通過(guò)輸入基因獲得與該基因相關(guān)的疾病信息[14]。在該數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇基因進(jìn)行檢索，依次輸入HQJZ的作用靶點(diǎn)，獲取作用靶點(diǎn)類(lèi)型（protein class）。
1.7 靶點(diǎn)生物功能注釋分析
DAVID 6.8（https://david. ncifcrf.gov/）是高通量的生物數(shù)據(jù)功能分析挖掘工具，旨在系統(tǒng)全面地為大規(guī)模基因或蛋白質(zhì)列表提供生物學(xué)功能注釋信息，進(jìn)而挖掘生物學(xué)意義[15]。將獲得的HQJZ活性成分潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入功能注釋工具，限定研究物種為人類(lèi)，選擇Gene Ontology下的分子功能（molecular function）、生物過(guò)程（biological process）和細(xì)胞組成（cellular component）3個(gè)部分進(jìn)行GO富集分析，選擇Pathway分析中KEGG Pathway，設(shè)定顯著性為P＜0.05，進(jìn)一步尋找活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的主要功能注釋與體內(nèi)通路，最后利用OriginPro9.1繪制條形圖展示富集結(jié)果。
1.8 靶點(diǎn)通路圖繪制
利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.kegg.jp/）中的KEGG Mapper工具，將“1.3”項(xiàng)下所得作用靶點(diǎn)
1.9 潛在活性成分-靶蛋白分子對(duì)接
為了進(jìn)一步驗(yàn)證靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，對(duì)篩選所得的活性成分及其相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。首先通過(guò)PDB（http://www.rcsb.org/pdb/）找到相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的PDB ID，導(dǎo)入Systems Dock Web Site（http://systemsdock.unit.oist.jp/），對(duì)HQJZ中活性成分和靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，根據(jù)對(duì)接Score值來(lái)判斷活性成分與靶蛋白的匹配度[16]。Score值越大，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。一般Score值在4.25以上認(rèn)為是有一定的結(jié)合活性，大于5.0的說(shuō)明分子與靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性，大于7.0則說(shuō)明分子與靶點(diǎn)的結(jié)合構(gòu)型具有強(qiáng)烈的活性[17]。
2 結(jié)果
2.1 HQJZ活性成分的篩選
通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及文獻(xiàn)整理，共收集到HQJZ的化學(xué)成分1 523個(gè)，其中黃芪146個(gè)、甘草396個(gè)、桂枝237個(gè)、白芍79個(gè)、大棗234個(gè)、生姜430個(gè)、飴糖1個(gè)。通過(guò)OB≥40%和DL≥0.20進(jìn)一步篩選得到黃芪的潛在活性成分17個(gè)。此外，黃芪皂苷I、II、III和IV的OB值雖較低，但均已被證實(shí)為黃芪的活性成分，因此也被納入潛在的活性成分。同理，甘草中的甘草酸、18β-glycyrrhetinic acid、異甘草素和甘草苷，桂枝中的桂皮醛、原兒茶酸、香豆素和桂皮酸，生姜中的6-姜辣素，同樣被認(rèn)為是潛在的活性成分。最終確定復(fù)方中共118個(gè)潛在活性成分，其中，黃芪、甘草、桂枝、白芍、大棗、生姜和飴糖的潛在活性成分分別為20、69、8、11、16、5和1個(gè)（表1）。
將潛在活性成分的Smiles格式上傳到SwissTarget Prediction，得到所有成分的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)1 689個(gè)。其中，黃芪的潛在作用靶點(diǎn)有302個(gè)、甘草902個(gè)、桂枝114個(gè)、白芍130個(gè)、大棗159個(gè)、生姜74個(gè)、飴糖8個(gè)。通過(guò)Genecard與OMIM搜索到與慢性萎縮性胃炎有關(guān)的基因靶點(diǎn)分別為148個(gè)與33個(gè)，合并去重后，與Swiss Target Prediction所得的作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，最終獲得16個(gè)HQJZ治療慢性萎縮性胃炎的潛在基因靶點(diǎn)（CYP1A2、XDH、BCL2、PPARG、EGFR、MMP2、CYP17A1、ODC1、PTGS2、NOS2、ALDH2、MMP9、MIF、AKT1、PTPN11和VEGFA），見(jiàn)表2。
根據(jù)上述所得到的HQJZ中7種單味藥材、132個(gè)潛在活性成分與16個(gè)作用靶點(diǎn)，利用Cytoscape軟件中merge功能構(gòu)建“單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1）。結(jié)果表明，HQJZ的132個(gè)潛在活性成分中，與作用靶點(diǎn)直接相連的成分有52個(gè)，為治療慢性萎縮性胃炎的活性成分。其中槲皮素、穆坪馬兜鈴酰胺、dehydroglyasperins C和2-(3,4- dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-6-(3-methylbut-2-enyl) chromone4個(gè)成分能與3個(gè)及以上靶點(diǎn)連接，可被認(rèn)為是HQJZ的主要活性成分。其次，靶基因
2.4 活性成分-靶蛋白分子對(duì)接分析
-enyl) chromone4個(gè)成分與16個(gè)靶蛋白進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這4個(gè)成分與16個(gè)靶蛋白對(duì)接Score值均在4.25以上，表明具有良好的相互作用，同時(shí)也驗(yàn)證了預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的可靠性（表3）。
2.5 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析
將上述作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，利用Cytoscape軟件繪制蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2）。圖中共涉及節(jié)點(diǎn)15個(gè)、邊47個(gè)（其中ALDH2未在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到，該蛋白不在蛋白關(guān)系網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)）。節(jié)點(diǎn)的大小代表其degree值，節(jié)點(diǎn)越大，表示其degree越大。邊的粗細(xì)表示Combine score，邊越粗，Combine score值越大。其中具有較大度（degree＝10）的蛋白質(zhì)為EGFR、VEGFA與BCL2，表明這些蛋白質(zhì)在整個(gè)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要的地位，同時(shí)這些作用靶點(diǎn)在HQJZ治療慢性萎縮性胃炎中具有重要的作用。
2.6 作用靶點(diǎn)類(lèi)型歸屬
將16個(gè)作用靶點(diǎn)依次導(dǎo)入DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得相應(yīng)的蛋白類(lèi)型（表4）。結(jié)果表明HQJZ治療
2.7 靶點(diǎn)生物功能分析
圖3為靶點(diǎn)的生物學(xué)過(guò)程富集分析，結(jié)果顯示16個(gè)潛在的作用靶點(diǎn)生物功能主要為細(xì)胞過(guò)程（10個(gè)靶點(diǎn)）、鐵離子結(jié)合（8個(gè)靶點(diǎn)）、免疫反應(yīng)（6個(gè)靶點(diǎn)）、氧水平調(diào)節(jié)（5個(gè)靶點(diǎn)）等，表明HQJZ可通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)生物過(guò)程治療慢性萎縮性胃炎?；?/span>KEGG代謝通路的分析結(jié)果（圖4）顯示，16個(gè)靶點(diǎn)主要與各種癌癥通路（9個(gè)靶點(diǎn)）、病灶黏連（4個(gè)靶點(diǎn)）、精氨酸和脯氨酸代謝（3個(gè)靶點(diǎn)）、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（3個(gè)靶點(diǎn)）與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路（3個(gè)靶點(diǎn)）等有關(guān)，表明HQJZ的活性成分靶點(diǎn)分布于不同的通路，可通過(guò)各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。
2.8 靶點(diǎn)通路分析
如圖5所示，圖中箭頭表示促進(jìn)作用，T-箭頭表示抑制作用。4種顏色代表不同的通路，其中藍(lán)色代表病灶黏連，綠色代表癌癥通路，橙色代表VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，灰色代表神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路。通路靶點(diǎn)用藍(lán)色背景表示，HQJZ作用靶點(diǎn)用綠色背景表示。圖中涉及9個(gè)HQJZ作用靶點(diǎn)，這些作用靶點(diǎn)通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體中多個(gè)環(huán)節(jié)與通路發(fā)揮治療作用。
3 討論
HQJZ治療“虛勞里急，諸不足”，對(duì)脾虛引起的慢性萎縮性胃炎治療效果頗佳，然其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥整體觀的思想基本一致，有助于系統(tǒng)全面闡釋其治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制。
本研究通過(guò)OB和DL值篩選得到HQJZ中132個(gè)潛在的活性成分，且部分成分的有效性已被證實(shí)。
黃芪中主要成分黃芪甲苷可減輕甲基硝基亞硝基胍（MNNG）誘導(dǎo)的胃癌大鼠癌前病變，改善大鼠胃黏膜異型增生[18]；毛蕊異黃酮可以抑制Akt信號(hào)通路，增強(qiáng)化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的作用及敏感性[19]。甘草中licochalcone A可顯著清除幽門(mén)螺桿菌感染，降低由幽門(mén)螺旋桿菌感染導(dǎo)致的誘導(dǎo)型一白芍中芍藥苷可以通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）通路進(jìn)而治療胃癌[21]。桂枝中主要含有桂皮酸、桂皮醛等成分，可緩和胃腸刺激，興奮胃液分泌而健胃[22]。生姜中含有較多姜辣素，其中6-姜辣素含量較高且穩(wěn)定[23]，可通過(guò)阻滯細(xì)胞于G2/M
2- enyl) chromone 4個(gè)成分與疾病靶點(diǎn)連接頻率較高，暗示其可能為HQJZ發(fā)揮治療。
本研究中，采用活性成分與已知配體的相似度預(yù)測(cè)潛在活性靶點(diǎn)，綜合OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中與慢性萎縮性胃炎有關(guān)的疾病靶點(diǎn)，最終獲得HQJZ治療慢性萎縮性胃炎的16個(gè)靶點(diǎn)。這些作用靶點(diǎn)中，HQJZ可通過(guò)降低基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）的表達(dá)水平，修復(fù)胃黏膜損傷[26]；通過(guò)改善一氧化氮合成酶（NOS）表達(dá)量復(fù)建胃黏膜防護(hù)因子，進(jìn)而保護(hù)胃黏膜[3]；通過(guò)抑制MMP2的表達(dá)，提高胃癌患者的生存率[27]。本實(shí)驗(yàn)中預(yù)測(cè)的靶點(diǎn)與文獻(xiàn)報(bào)道的HQJZ藥理作用相一致，說(shuō)明了預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的可靠性。
單味藥-活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)顯示了HQJZ多成分、多靶點(diǎn)治療慢性萎縮性胃炎的特點(diǎn)。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)表明HQJZ的靶蛋白之間存在著相互關(guān)系，是一個(gè)復(fù)雜交錯(cuò)的網(wǎng)絡(luò)，并非單獨(dú)發(fā)揮作用。HQJZ治療慢性萎縮性胃炎的作用靶點(diǎn)主要由信號(hào)分子、轉(zhuǎn)錄因子、多種酶等物質(zhì)參與。因此，這些作用靶點(diǎn)共同作用、互相調(diào)節(jié)可能是HQJZ增強(qiáng)治療作用的機(jī)制。
靶點(diǎn)生物學(xué)過(guò)程分析結(jié)果可知，HQJZ的作用靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞過(guò)程的增殖與凋亡、與鐵離子結(jié)合并參與免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)氧水平等生物過(guò)程發(fā)揮治療作用。這些生物過(guò)程與組織的保護(hù)作用有關(guān)，可從多個(gè)水平參與病理組織的恢復(fù)過(guò)程，與文獻(xiàn)報(bào)道相吻合[5,28-29]。因此，HQJZ可以通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)靶點(diǎn)、參與多種生物學(xué)過(guò)程治療慢性萎縮性胃炎。
基于KEGG代謝通路的分析結(jié)果顯示，HQJZ靶基因的代謝通路主要涉及癌癥通路、病灶黏連、精氨酸和脯氨酸代謝、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路等。慢性萎縮性胃炎為胃癌癌前病變[30]，控制細(xì)胞的增殖與凋亡對(duì)防止細(xì)胞發(fā)生癌變具有重要作用。本研究中56.3%的作用靶點(diǎn)與癌癥通路相關(guān)，其中，EGFR屬于受體酪氨酸激酶，與細(xì)胞增殖、凋亡基因的轉(zhuǎn)錄有密切關(guān)系[31]，有實(shí)驗(yàn)證明HQJZ可逆轉(zhuǎn)脾虛型慢性萎縮性胃炎大鼠胃黏膜EGFR及其受體基因mRNA的異常表達(dá)[32]。
VEGF可以通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管通透性增加，促進(jìn)腫瘤血管的形成，在慢性萎縮性胃炎和胃癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[34-35]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，HQJZ亦可調(diào)節(jié)胃黏膜損傷模型大鼠VEGF蛋白的表達(dá)，修復(fù)胃黏膜損傷[36]。推測(cè)HQJZ可通過(guò)影響VEGF信號(hào)通路進(jìn)而影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移與修復(fù)。
對(duì)病灶黏連通路中基因的靶向治療可顯著的抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖[37]。圖5顯示，受體酪氨酸激酶（RTK）與Caveolin在病灶黏連通路中發(fā)揮了重要的作用，可影響胃癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移與增殖過(guò)程，且病灶黏連與癌癥信號(hào)通路中涉及的絲裂原活化蛋白激酶（MEK）與磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）等蛋白均有關(guān)系，提示這些靶點(diǎn)在HQJZ治療慢性萎縮性胃炎中發(fā)揮著重要的作用。
神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（NTF）是一類(lèi)由神經(jīng)支配的組織或星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子，在慢性萎縮性胃炎的發(fā)病中發(fā)揮了重要的作用，其中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）的研究較多[38]。通路分析顯示HQJZ可通過(guò)影響神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 [BDNF與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子4（NT4）] 受體發(fā)揮治療作用。
有研究表明精氨酸和脯氨酸代謝參與了氧化應(yīng)激、胃腸道菌群調(diào)控等多個(gè)生化反應(yīng)，與慢性萎縮性胃炎的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[39-40]。本課題組前期工作證實(shí)慢性萎縮性胃炎大鼠的血漿中與精氨酸和脯氨酸代謝有關(guān)的精氨酸、脯氨酸和瓜氨酸含量均減少，經(jīng)HQJZ治療后，瓜氨酸含量顯著升高[41]，證明HQJZ可通過(guò)調(diào)節(jié)精氨酸和脯氨酸代謝通路治療慢性萎縮性胃炎。
本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析HQJZ治療慢性萎縮性胃炎的作用機(jī)制，HQJZ通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的癌癥通路、病灶黏連、精氨酸和脯氨酸代謝、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路等發(fā)揮治療作用。本研究相關(guān)通路的分析與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，表明預(yù)測(cè)的潛在活性成分與靶點(diǎn)具有一定的可靠性。因此，HQJZ中52個(gè)活性成分通過(guò)調(diào)控16個(gè)靶點(diǎn)、參與5條主要通路，共同作用治療慢性萎縮性胃炎，體現(xiàn)了HQJZ多成分、多靶點(diǎn)、多途徑治療的特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法也體現(xiàn)了中醫(yī)藥的整體觀與系統(tǒng)性，為中醫(yī)藥治療多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病提供了新的途徑。
參考文獻(xiàn)（略）
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