點(diǎn)評(píng)丨李勁松（中科院生化細(xì)胞所）
責(zé)編丨迦溆
同性生殖（unisexual reproduction）的現(xiàn)象在動(dòng)物中并不罕見(jiàn)，例如在爬行類(lèi)的蜥蜴，兩棲類(lèi)的蛙，以及多種魚(yú)類(lèi)中，都有“孤雌生殖”現(xiàn)象：即不經(jīng)過(guò)與雄性的交配，雌性個(gè)體即可生下后代【1】。作為有性生殖的補(bǔ)充，孤雌生殖（gynogenesis）能在缺乏雄性的情況下，維持個(gè)體的繁衍與種群的更新。與孤雌生殖對(duì)應(yīng)的孤雄生殖則極其罕見(jiàn)，迄今只在一種斑馬魚(yú)中發(fā)現(xiàn)孤雄生殖。然而對(duì)于高等哺乳動(dòng)物，無(wú)論孤雌生殖或孤雄生殖都不存在。
科學(xué)家們?nèi)斯?gòu)建出的孤雌或孤雄胚胎均在發(fā)育早期死亡。在爬行類(lèi)和兩棲類(lèi)不存在、而在哺乳類(lèi)進(jìn)化出來(lái)的印記基因被認(rèn)為是阻礙哺乳動(dòng)物同性生殖的重要因素。早在上世紀(jì)80年代，以德國(guó)馬普所的Davor Solter和劍橋的Azim Surani為代表的科學(xué)家差不多在同一時(shí)間通過(guò)核移植實(shí)驗(yàn)證明了只有同時(shí)具備雙親染色體的胚胎才能存活，而含有兩份父源基因組（biparental gynogenones）或者兩份母源基因組（biparental androgenones）的胚胎則不能完成正常的胚胎發(fā)育【2】，這表明父源和母源基因組對(duì)于胚胎發(fā)育的貢獻(xiàn)存在較大的差異性，首次提出了印記基因（imprinted genes）的概念【3】（因?yàn)閷?duì)印跡基因領(lǐng)域的杰出貢獻(xiàn)，Davor Solter和Azim Surani共同獲得2018年度加拿大蓋爾德納獎(jiǎng)，Canada Gairdner Award）。
據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的印記基因超過(guò)100個(gè)【4】，隨機(jī)分布于染色體的數(shù)十個(gè)區(qū)段上，表達(dá)模式由印記控制區(qū)段的差異甲基化來(lái)控制。東京農(nóng)業(yè)大學(xué)Kono實(shí)驗(yàn)室曾在未成熟卵中刪除了2個(gè)印記控制區(qū)段，成功得到了活的孤雌小鼠，首次實(shí)現(xiàn)了哺乳動(dòng)物的孤雌生殖【5，6】，曾引起廣泛關(guān)注。然而許多新的科學(xué)問(wèn)題也隨之而來(lái)：為什么在眾多印記區(qū)段中，僅僅改變兩個(gè)即可實(shí)現(xiàn)孤雌生殖？這些孤雌小鼠為什么有發(fā)育缺陷？孤雄生殖有可能在最高等的哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)嗎？
10月11日，中科院動(dòng)物研究所胡寶洋研究員與周琪院士、李偉研究員組成的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)在Cell Stem Cell雜志上發(fā)表了題為Generation of Uniparental Mice from Hypomethylated Haploid ESCs with Imprinting Region Deletions的研究論文，結(jié)合單倍體干細(xì)胞技術(shù)和基因編輯技術(shù)對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探索，首次獲得具有兩個(gè)父系基因組的孤雄小鼠，具有十分重要的意義。
該研究團(tuán)隊(duì)首先發(fā)現(xiàn)，由卵細(xì)胞建立的孤雌單倍體干細(xì)胞，在高代次條件下，刪除與Kono實(shí)驗(yàn)室相同的兩個(gè)印記區(qū)段并注射進(jìn)第二個(gè)卵細(xì)胞后，同樣能發(fā)育得到“兩個(gè)母親”的孤雌小鼠。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高代次的孤雌單倍體細(xì)胞展現(xiàn)出了一種不同于卵子或較低代次細(xì)胞，反而類(lèi)似原始生殖細(xì)胞的全基因組甲基化模式，且所有的印記區(qū)段都呈現(xiàn)出類(lèi)似原始生殖細(xì)胞的“無(wú)印記”狀態(tài)。這揭示了為何 “僅僅刪除2個(gè)”印記區(qū)段，就能獲得孤雌小鼠：實(shí)際上，所有繼承自卵細(xì)胞的印記基因，在孤雌單倍體干細(xì)胞中都經(jīng)歷了印記模式的“重新修正”。與此結(jié)果一致的是，研究人員發(fā)現(xiàn)在孤雌小鼠中，除了一個(gè)印記基因(Rasgrf1)表達(dá)顯著異常之外，其他所有印記基因都與正常小鼠無(wú)異。
利用單倍體干細(xì)胞易于基因編輯的特性，研究人員在孤雌單倍體干細(xì)胞中同時(shí)刪除了包含Rasgrf1在內(nèi)的三個(gè)印記區(qū)段。發(fā)育結(jié)果證實(shí)，Kono獲得的孤雌小鼠的多種缺陷，確實(shí)是Rasgrf1的異常所導(dǎo)致的：人們首次獲得了在發(fā)育、行為、代謝和生育力上均與正常小鼠無(wú)異的孤雌小鼠。更令人驚訝的是，在由精子建立的孤雄單倍體干細(xì)胞中，同樣發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似原始生殖細(xì)胞的甲基化模式。這意味著，在低等脊椎動(dòng)物中罕見(jiàn)的孤雄生殖，有可能在哺乳動(dòng)物中實(shí)現(xiàn)。
研究人員在孤雄單倍體干細(xì)胞中，篩選并最終刪除了7個(gè)重要的印記控制區(qū)段（Nespas，Grb10，Igf2r，Snrpn，Kcnq1，Peg3，Gnas）。這些細(xì)胞與另一顆精子所形成的孤雄胚胎干細(xì)胞，發(fā)育成為了活的孤雄小鼠。這些孤雄小鼠外觀正常，可以自主呼吸，但是都在出生后48小時(shí)內(nèi)死亡。這是首次獲得具有兩個(gè)父系基因組的孤雄小鼠，證實(shí)了即便在最高等的哺乳動(dòng)物中，孤雄生殖也有可能實(shí)現(xiàn)。
總的來(lái)說(shuō)，該項(xiàng)研究利用單倍體胚胎干細(xì)胞技術(shù)作為平臺(tái)，系統(tǒng)證明了哺乳動(dòng)物中跨越同性生殖障礙需要經(jīng)歷的三步：1、單倍體干細(xì)胞展現(xiàn)出類(lèi)似原始生殖細(xì)胞的“無(wú)印記”模式；2、在單倍體干細(xì)中對(duì)特定印記區(qū)段進(jìn)行修飾，建立新的印記模式；3、結(jié)合卵母細(xì)胞注射或四倍體囊胚補(bǔ)償技術(shù)獲得孤雌或孤雄動(dòng)物。該研究也證實(shí)了，更完善的印記修飾能夠完全跨越孤雌生殖障礙，獲得健康發(fā)育的孤雌動(dòng)物。得到孤雄小鼠需要更多的印記修飾，而所有的孤雄小鼠均無(wú)法存活至成年，意味著相比孤雌生殖，孤雄生殖有著更多的障礙。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)理解基因組印記的進(jìn)化、調(diào)控和功能具有重要意義，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的動(dòng)物生殖手段也有重要價(jià)值。
據(jù)悉，該研究工作由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所和中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院完成。中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所胡寶洋研究員、周琪研究員和李偉研究員為論文的共同通訊作者；博士后李治琨、王樂(lè)韻、博士生王立賓、袁雪薇以及馮桂海副研究員為共同第一作者。
參考文獻(xiàn)：
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專(zhuān)家點(diǎn)評(píng)
李勁松（中科院生化與細(xì)胞所研究員）
印記基因?qū)τ诟叩炔溉閯?dòng)物的胚胎發(fā)育發(fā)揮重要的調(diào)控作用【1】。上世紀(jì)80年代，Surani教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)構(gòu)建小鼠單親二倍體胚胎的方式證明父源DNA拷貝和母源DNA拷貝在遺傳上的不等價(jià)性【2】。其不等價(jià)性的重要原因是不同來(lái)源的DNA拷貝攜帶著不同的甲基化修飾，這些攜帶修飾的區(qū)域使其周?chē)虬l(fā)生等位基因之間的差異性表達(dá)【3】。
2007年，Kono教授團(tuán)隊(duì)通過(guò)在未成熟卵母細(xì)胞中敲除H19-Igf2和Dlk1-Dio3兩個(gè)印記基因簇的調(diào)控區(qū)域并與成熟卵母細(xì)胞融合后成功獲得了能夠存活的孤雌小鼠，實(shí)現(xiàn)了孤雌生殖，相對(duì)完整地詮釋了父源高甲基化印記基因簇在小鼠胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用【4】。而孤雄生殖一直以來(lái)都有實(shí)驗(yàn)室在嘗試，但是并沒(méi)有獲得很大的突破，其重要原因是母源高甲基化印記基因簇?cái)?shù)量眾多。目前所知，小鼠印記基因簇超過(guò)23個(gè)，其中父源高甲基化印記基因簇只有3個(gè)，絕大多數(shù)為母源高甲基化印記基因簇【5】。所以，研究母源高甲基化印記基因簇對(duì)于胚胎發(fā)育的貢獻(xiàn)需要高效的基因編輯工具。
2016年，胡寶洋研究員團(tuán)隊(duì)和我們課題組在Cell research雜志上同期報(bào)道【6】【7】，將H19-Igf2和Dlk1-Dio3印記基因簇調(diào)控區(qū)域敲除的孤雌單倍體胚胎干細(xì)胞注射進(jìn)MII的卵母細(xì)胞中可以穩(wěn)定獲得出生的小鼠，證明了單倍體胚胎干細(xì)胞進(jìn)行印記基因簇調(diào)控區(qū)域敲除可以有效地模擬精子的印記狀態(tài)。
在本文中，胡寶洋研究員團(tuán)隊(duì)及其合作團(tuán)隊(duì)以單親生殖為出發(fā)點(diǎn)，利用單倍體胚胎干細(xì)胞為工具，在敲除H19-Igf2和Dlk1-Dio3兩個(gè)印記基因簇的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了敲除Rasgrf1印記基因簇可以提升孤雌胚胎的發(fā)育狀態(tài)，補(bǔ)充了父源高甲基化印記基因簇對(duì)于胚胎發(fā)育的貢獻(xiàn)；并且通過(guò)對(duì)孤雄單倍體胚胎干細(xì)胞七個(gè)母源高甲基化印記基因簇調(diào)控區(qū)域的敲除成功地代替了卵子遺傳物質(zhì)，獲得了出生的孤雄小鼠，實(shí)現(xiàn)了孤雄生殖，為研究母源高甲基化印記基因簇對(duì)于胎兒發(fā)育的貢獻(xiàn)奠定了重要基礎(chǔ)。而本文中攜帶多調(diào)控區(qū)域敲除的重構(gòu)胚胎并不能直接發(fā)育到期，需要通過(guò)四倍體補(bǔ)償?shù)姆绞桨l(fā)育到期，說(shuō)明與胎盤(pán)相關(guān)的母源高甲基化印記基因簇在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用還有許多未知內(nèi)容有待探索。本研究顯示，單倍體胚胎干細(xì)胞作為配子替代物構(gòu)建胚胎的研究體系為胚胎發(fā)育調(diào)控研究提供了新工具。
參考文獻(xiàn)：
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【5】http://www.mousebook.org/mousebook-catalogs/imprinting-resource
【6】Li, Z., Wan, H., Feng, G., Wang, L., He, Z., Wang, Y., Wang, X.J., Li, W., Zhou, Q., and Hu, B. (2016). Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells. Cell Res.26, 135–138.
【7】Zhong C, Xie Z, Yin Q, Dong R, Yang S, Wu Y, Yang L, Li J. (2016) Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Cell Research.26, pages131–134.
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