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可變剪接提供了一種對神經(jīng)元特異基因表達十分重要的機制。一些在神經(jīng)元細胞中廣泛表達的RNA結合蛋白與控制發(fā)育調控且神經(jīng)元特異的可變剪接程序有關，單一蛋白能夠調控許多靶標轉錄本。然而，一些RNA結合蛋白都是在神經(jīng)元集群中選擇性表達，增加了其可能控制細胞類型特異和突觸特異的功能的可能性。KH結構域RNA結合蛋白SLM2就是這樣一個在小鼠海馬體的谷氨酸能錐體細胞和一些特定的釋放γ-氨基丁酸（GABA）的中間神經(jīng)元中高表達的RBP。

SLM2對小鼠海馬體中的谷氨酸能突觸的功能特性至關重要?；蚪M范圍內的比對揭示具有明顯選擇性的SLM2依賴的剪接程序主要由少量編碼突觸蛋白的靶標mRNA組成。在Slm2敲除的小鼠海馬體中雜合缺失Nrxn1的21號外顯子能夠恢復突觸表型，挽回突觸可塑性和行為缺陷。因此，SLM2對單一可變外顯子的調控對谷氨酸能突觸的功能和可塑性的規(guī)范及小鼠行為具有重要作用。

首先通過免疫組化和western blot對野生型和Slm2敲除小鼠的海馬體組織進行突觸結構和組分分析，再通過電生理學實驗檢測突觸的谷氨酸能傳導和可塑性。通過對兩種小鼠的海馬體組織進行RNA-seq獲得了轉錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)可變剪接分析得到了受SLM2調控的基因及可變剪接事件。推測SLM2調控的Nrxn1的21號外顯子可變剪接與該軸突蛋白和配體的互作有關，并通過免疫共沉淀初步證實。進一步假設Slm2敲除小鼠中喪失與這些軸突蛋白配體的跨突觸互作，可能導致突觸后谷氨酸受體缺陷，通過在Slm2敲除小鼠中雜合去除一個Nrxn1Δex21等位基因，進一步證實該推論。

（1）

Slm2敲除小鼠中的突觸結構和突觸組成。在Slm2敲除的小鼠中，能在海馬體CA1神經(jīng)元的初級頂樹突上形成正常數(shù)量的谷氨酸能棘突觸（圖1A和B）。WB分析來自野生型和Slm2敲除小鼠海馬體的突觸體組分，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)出整體正常的谷氨酸能突觸蛋白濃度。然而，AMPA型谷氨酸受體（AMPAR）亞基GluA1增多，尤其是在來自成熟的Slm2敲除小鼠突觸體的洗滌劑可溶組分中（圖1和D）。在來自未成年小鼠的急性切片中，GluA1數(shù)量在全細胞裂解液和細胞表面組分中都升高，而N-甲基-D-天冬氨酸受體GluN1亞基的表達沒有變化（圖1 E和F）。

 圖1.

（2）

SLM2是正常谷氨酸能傳導和可塑性所必需的。野生型與Slm2敲除小鼠海馬體的CA1神經(jīng)元切片中微小興奮性突觸后電流（mEPSC）振幅和頻率沒有差別（圖2A和B），但后者中mEPSC事件的上升速度和衰減時間表現(xiàn)出微小的增加（圖2C和D）。在Slm2敲除的小鼠中，AMPA受體和NMDA受體介導的興奮性突觸后電流比率（AMPAR/NMDAR）顯著升高（圖2E和F）。與野生型相比，在Slm2敲除的CA1神經(jīng)元中，刺激謝弗側支引起了更大的突觸后反應（圖2G），而雙脈沖易化正常（圖2H）。證實Slm2敲除小鼠CA1神經(jīng)元中突觸后AMPA受體表面表達及功能的提升。

 圖2.

（3)

SLM2依賴的可變剪接程序的基因組范圍比對。在全基因組范圍內對SLM2依賴的可變剪接事件進行比對，發(fā)現(xiàn)不同基因型之間轉錄本的表達高度相關，表明SLM2不在調控整體的轉錄本水平中發(fā)揮主要功能（圖3A）。野生型和Slm2敲除的小鼠海馬體中絕大多數(shù)外顯子基本保持不變（圖3B），但有四個基因的可變外顯子在敲除小鼠中表現(xiàn)出了不同程度的異常調控。編碼突觸細胞表面受體的三個軸突蛋白基因（Nrxn1，2和3）的可變剪接片段4（AS4）中的外顯子水平增加了2倍以上，而囊泡融合機制的一個組分tomosyn-2（Stxbp5l）的24號外顯子水平提高了1.58倍。另外7個外顯子盡管變化倍數(shù)不高，仍然表現(xiàn)出顯著變化（P<>

 圖3.

(4)

在Slm2敲除的海馬體中Nrxn1的21號外顯子雜合缺失恢復了突觸表型。發(fā)生在Nrxn AS4上的可變剪接，調控突觸前末梢軸突蛋白的選擇性跨突觸互作。實驗發(fā)現(xiàn)21個受其調控的候選互作蛋白，六個顯著差異蛋白中包括神經(jīng)連接蛋白，Chadl，LRRTMs和補體C3（圖4B）。

假設Slm2敲除的小鼠海馬體中Nrxn的可變剪接可能會擾亂其與這些剪接插入敏感配體之間的互作。對其進行免疫共沉淀分析，在野生型小鼠的沉淀中發(fā)現(xiàn)大量神經(jīng)連接蛋白1（NL1）和3（NL3），它們都在Slm2敲除小鼠的沉淀中減少（圖4C），而補體C3的共沉淀則輕微上升，證實SLM2的喪失確實轉換了突觸受體-配體互作關系。在Slm2敲除小鼠中喪失與這些軸突蛋白配體的跨突觸互作，可能導致突觸后谷氨酸受體缺陷。為了驗證這一假設，在Slm2敲除小鼠中雜合去除一個Nrxn1Δex21等位基因，恢復了正常Nrxn1 AS4(-)轉錄本水平（圖4D），從而挽救了內源軸突蛋白與NL1和NL3的跨突觸細胞表面互作（圖4E），并使急性海馬體切片中GluA1量正常化（圖4F），部分恢復了短陣快速脈沖誘導的謝弗側支LTP（圖4G），且挽救了小鼠的行為變化（圖4H和I）。因此，SLM2對單一可變外顯子的調控對谷氨酸能突觸功能的特化，可塑性，和小鼠行為具有重要貢獻。

 圖4.

與其他RNA結合蛋白相比，SLM2表現(xiàn)出高度選擇性的神經(jīng)細胞類型特異的表達，且僅有一小部分可變的外顯子特異的依賴其功能?；蛘葘嶒炞C實單一可變外顯子的恢復對SLM2敲除小鼠的表型具有重要影響。猜測這里報道的針對SLM2-軸突蛋白系統(tǒng)的表面受體識別系統(tǒng)的定向，細胞類型特異性的剪接調控，代表了神經(jīng)回路中一種調控突觸特化的通用機制。

Traunmüller, L., A. M. Gomez, T. M. Nguyen and P. Scheiffele (2016). 'Control of neuronal synapse specification by a highly dedicated alternative splicing program.' Science 352(6288).