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免疫沉淀和免疫印跡（Western Blotting）

     在細(xì)胞生物學(xué)研究中，有時(shí)要對(duì)細(xì)胞膜分子、胞內(nèi)分子或表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行定性或／和定量。但由于靶蛋白表達(dá)水乎不太高，用細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳、免疫印跡（Western blot）檢測(cè)很難達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。為此可用特異性識(shí)別靶蛋白的抗體進(jìn)行免疫沉淀，純化和富集靶抗原。免疫沉淀所獲得的蛋白可進(jìn)行SDS－PAGE電泳，經(jīng)考馬氏亮藍(lán)染色或銀染后觀察目的蛋白條帶。如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考馬氏亮藍(lán)染色或銀染的檢測(cè)下限，可采用 Western blot檢測(cè)方法，提高檢測(cè)的靈敏度，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>

免 疫 沉 淀

     （一）原理

免疫沉淀是利用抗原抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細(xì)胞裂解液或表達(dá)上清中相應(yīng)的蛋白結(jié)合后，再與蛋白 A／G（Protein A／G）或二抗偶聯(lián)的agaose或Sepharose珠子孵育，通過(guò)離心得到珠子－蛋白A／G或二抗－抗體－目的蛋白復(fù)合物，沉淀經(jīng)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5－10 min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

     （二）試劑

    1．PBS：8g NaCl、0.2 g KCl、1.44g Na₂HPO₄、0.24g KH₂PO₄溶于800 ml雙蒸水中，用HCl調(diào)PH至7.4，在補(bǔ)加水至1L，高壓滅菌后保存于室溫。

    2．NaCl：5.8 g NaCl溶于 80 ml雙蒸水中，再補(bǔ)加水至100 ml，高壓滅菌。

    3.1 1M Tris（pH 7.5）: 12.1g Tris堿，溶于80 ml雙蒸水，用 HCl調(diào) pH至7.5，再補(bǔ)加水至100 ml。

    4．蛋白酶抑制劑：Aprotinin和Leupeptin溶于雙蒸水，PMSF溶于異丙醇，濃度均為10 mg/ml。

    5．N-40：10％（w／V）。

    6．脫氧膽酸鈉：10％（w／v），溶于10 mM HEPES（pH 8.0）。

    7．細(xì)胞裂解液：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg/ml PMSF、1 ug/ml Aprotinin、1ug/ml Leupeptin、l％NP-40、0.5％脫氧膽酸鈉。

    8．稀釋液：50 mM Tris（PH 7.5）、150 mM NaCl、0.1 mg／ml PMSF、1 ug／ml Aprotinin，1 ug/ml  Leupeptin、0.1％NP-40。

    9．洗滌液 Ⅰ：50 mM Tris（pH 7.5）、150 mM NaCl、0.1％NP-40。

    10．洗滌液Ⅱ：10  mM  Tris（pH 7.5）。

    11．Protein  A／G－Agarose。

12．2×SDS－PAGE電泳上樣緩沖液：100 mM  Tris（pH 6.8）、200 mM DTT、4％SDS、0.2％溴酚藍(lán)、20％甘油。

    （三）操作步驟

    1．離心收集細(xì)胞，PBS洗滌2次。細(xì)胞用量根據(jù)目的蛋白表達(dá)的水平而定，一般用 1×107－5×107 細(xì)胞。

    2．按 1×107 細(xì)/ml加人細(xì)胞裂解液，于冰浴上超聲破碎，然后再冰浴 30 min。

    3．4℃ 12 000 ×g離心 10 mn，取上清。

    4．往上清中加人50 ul的蛋白 A／G－agarose，于4℃在搖床上溫和搖1－3 h進(jìn)行預(yù)清除。

    5．12 000轉(zhuǎn)離心20 s，取上清。

    6．將上清等分成兩份，補(bǔ)加稀釋液至1ml，其中一份加人1－10 ug識(shí)別目的蛋白的抗體，另一份加人等量的對(duì)照抗體，于4℃在搖床上溫和搖2 h，然后加入50 ul的蛋白A／G－Agarose于4℃在搖床上溫和搖過(guò)夜。

    7．離心棄上清，用洗滌液Ⅰ洗沉淀4次，洗滌液Ⅱ洗 2次，每次洗滌于4℃在搖床上溫和搖20 min。

    8．離心棄上清，用4號(hào)針頭盡可能移去液體。

9．加人20－50 ul的電泳上樣緩沖液，于100℃煮5－10 min，離心收集上清。上清中含有目的蛋白和抗體，可進(jìn)一步用蛋白電泳和Western blot進(jìn)行定性和定量。

    （四）注意事項(xiàng)

    1．不同種屬來(lái)源及不同亞類(lèi)的抗體與蛋白A和蛋白G的－結(jié)合力不同（表），有的甚至不能結(jié)合，如小鼠的 IgM，這類(lèi)抗體不能用蛋白 A／G－agarose直接免疫沉淀。

    2．PMSF對(duì)身體有害，注意防護(hù)。

3．根據(jù)免疫沉淀的結(jié)果，洗滌液Ⅰ的鹽離子濃度可作一定的調(diào)整，如果沉淀的雜蛋白較多可適當(dāng)增加鹽濃度，如果抗體與目的蛋白的結(jié)合力較弱則適當(dāng)減低鹽濃度。

不同種屬和不同亞類(lèi)抗體與Protein A、Protein G的結(jié)合力

w：Weak binding，S：Strong binding，w／s：Indifferent，

nb：No binding，—：Information not available

免疫印跡（Western blotting）

 (一)原理

 Western blot是一種在 PVDF或硝酸纖維素（NC）膜上進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)。蛋白電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標(biāo)記的二抗孵育，再進(jìn)行底物顯色。由于抗原抗體反應(yīng)特異性好，親合力高，Western blot檢測(cè)的靈敏度較高，尤其是采用酶促增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的方法（ECL）后，檢測(cè)的下限可達(dá)到pg水平。ECL是指酶催化底物發(fā)熒光，熒光可使X光片曝光。由于酶標(biāo)記在二抗上，二抗與一抗結(jié)合，而一抗特異性結(jié)合在目的蛋白條帶處，因此顯影、定影后觀察到的條帶即為目的蛋白帶。

（二）試劑和材料

1. PVDF膜或NC膜。

2.電泳緩沖液：25 mM Tris堿、250 mM甘氨酸、0.1％SDS。

3.轉(zhuǎn)移緩沖液：實(shí)驗(yàn)所用的PVDF或NC膜不同，轉(zhuǎn)移緩沖液也可能不同，因此請(qǐng)仔細(xì)參閱PVDF或NC膜說(shuō)明書(shū)。

4.TBS（pH7.5）：6.05 g Tris堿（50mM）、8.76g NaCl（150mM）溶于800 ml雙蒸水,用 HCl調(diào) PH至7.5，補(bǔ)加水至1L。

5.TBST：TBS＋0.1％（v／v）Tween 20。

6.封閉液：1％試劑盒中的封閉液，或5％脫脂奶粉，溶于TBS中。

7.解離液：100 mM 二巰基乙醇、2％SDS。

8.化學(xué)發(fā)光Western blot試劑盒：生產(chǎn)這類(lèi)試劑盒的公司包括 Roche、Pierce、Amersham 等，試劑盒中一般包括酶標(biāo)記二抗、發(fā)光波A和B。

（三）操作步驟

1. 灌制SDS－PAGE電泳膠，方法參見(jiàn)一般的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法。

2. 取免疫沉淀最后所得的上清,上樣，電泳。

3. 用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF或NC膜上。

4. 電轉(zhuǎn)移完畢后，取出膜,用TBS洗滌1次。

5. 將膜放入封閉液 于室溫封閉1 h, 或4℃封閉過(guò)夜。

6. 用封閉液稀釋識(shí)別目的蛋白的抗體至1－10 ug/ml，與含有目的蛋白條帶膜在室溫作用1 h。

7. TBST洗膜4次,每次15 min。

8. 按試劑盒說(shuō)明書(shū)稀釋酶標(biāo)記二抗,與膜于室溫作用30min。

9. TBST洗膜4次，每次15 min。

10. 按試劑盒說(shuō)明書(shū)混合發(fā)光液A和B，與膜作用1 min后進(jìn)行X光片曝光。

11. X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。

12. 如果結(jié)果不理想或要用相同的膜檢測(cè)另一種靶蛋白，可將膜與解離液于50℃作用30 min，去除結(jié)合于膜上的抗體, TBST洗2次，封閉后可重新檢測(cè)（即重復(fù) 6－11步）。

 (四) 注意事項(xiàng)

1.用于 Western blot和免疫沉淀的抗體最好不同，否則將出現(xiàn)很多非特異性條帶。

2. Western blot中，轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，其空間結(jié)構(gòu)被改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于Western blot檢測(cè)。這種情況下，可將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用抗體進(jìn)行免疫沉淀，得到的生物素化的目的蛋白可用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行Western blot檢測(cè)。

3.化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的敏感度很高，實(shí)驗(yàn)中取膠和膜必須帶一次性手套。

4. 曝光、顯影和定影需在暗室中進(jìn)行，X光片用完后一定要收好，避免曝光。