專(zhuān)題一 基因工程
基因工程（原理：基因重組）：（DNA重組技術(shù)）按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組技術(shù)和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。
一、基因工程的基本工具
（一）限制酶
1、來(lái)源：從原核生物中分離提純。
2、功能：能夠識(shí)別雙鏈DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。
3、切割結(jié)果：（粘性末端和平末端）
【注】雙酶切：
（1）防止目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化。
（2）保證目的基因和質(zhì)粒按照順利連接。
（二）DNA連接酶
1、種類(lèi)：
2、功能：將兩條DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的磷酸二酯鍵。
【注】限制酶和DNA連接酶都作用于磷酸二酯鍵，而不是氫鍵。
（三）載體
1、結(jié)構(gòu)：例如 質(zhì)粒（見(jiàn)右圖）
2、載體需要具備的條件
（1）能在宿主細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并穩(wěn)定遺傳。
（2）具有一個(gè)至多個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)，以供外源DNA片段（即目的基因）插入其中。
（3）有特殊的標(biāo)記基因（例如抗生素抗性基因），供重組DNA的鑒定與選擇。
3、常用載體：（1）大腸桿菌的質(zhì)粒（天然質(zhì)粒經(jīng)過(guò)人工改造）。
（2） 噬菌體衍生物和動(dòng)植物病毒。
【需要通過(guò)載體而不能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原因：基因表達(dá)載體包括復(fù)制原點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子等結(jié)構(gòu)，而目的基因沒(méi)有?！?/p>
二、基因工程的基本操作程序
（一）目的基因的獲取
1、目的基因：為了獲得預(yù)期性狀，需要從供體細(xì)胞中獲得的基因，主要指編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。
2、
（1）基因文庫(kù)：將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)備。各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同基因。
【注】：真核細(xì)胞的基因有內(nèi)含子和外顯子（如圖）
（2）PCR技術(shù)
【前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列（目的是為了設(shè)計(jì)引物）】
①原理：DNA雙鏈復(fù)制（生物體外復(fù)制特定DNA片段的技術(shù)）
②材料：模板、原料（四種脫氧核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）、引物（成對(duì)存在）
③擴(kuò)增過(guò)程：
a.變性（90-95℃）：使DNA片段雙鏈解開(kāi)。
b.復(fù)性（55-60℃）：又稱(chēng)為退火，使連接DNA兩條單鏈分別與相應(yīng)的引物結(jié)合。
c.延伸（70-75℃）：熱穩(wěn)定DNA聚合酶催化引物起始合成子鏈。
④PCR技術(shù)與DNA復(fù)制的比較
DNA體內(nèi)復(fù)制 PCR技術(shù)
解旋方式 解旋酶催化 DNA在高溫下變性解旋
場(chǎng)所 細(xì)胞內(nèi) 體外
酶 解旋酶、DNA聚合酶 熱穩(wěn)定DNA聚合酶
溫度 細(xì)胞內(nèi)溫和條件 需要控制溫度
合成對(duì)象 DNA分子 DNA片段或基因
（二）基因表達(dá)載體的構(gòu)建——基因工程的核心
1、目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。
2、基因表達(dá)載體的組成：（如右圖）
（1）插入基因：即目的基因
（2）啟動(dòng)子：一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。
（3）終止子：一段特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的尾端，使轉(zhuǎn)錄在需要的地方停止下來(lái)。
（4）標(biāo)記基因：用于鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來(lái)。常用的標(biāo)記基因是抗生素抗性基因、產(chǎn)生特定顏色表達(dá)產(chǎn)物的基因、發(fā)光基因等。
（5）復(fù)制原點(diǎn)：載體在受體細(xì)胞中復(fù)制的起點(diǎn)。
3、基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：（如右圖）
4、基因表達(dá)載體去向：
（1）留在受體細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制。
（2）整合到受體細(xì)胞染色體DNA上。
（三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞
1、轉(zhuǎn)化：目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程。
2、 （1）受體細(xì)胞為植物細(xì)胞
①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→農(nóng)桿菌侵染植物（雙子葉植物受傷后產(chǎn)生酚類(lèi)物質(zhì)，吸引農(nóng)桿菌進(jìn)入植物細(xì)胞）細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上→表達(dá)。
【原理：目的基因隨農(nóng)桿菌中Ti質(zhì)粒上的T-DNA轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上】
②基因槍法：利用壓縮氣體產(chǎn)生的動(dòng)力，將包裹在金屬顆粒表面的表達(dá)載體DNA打入到受體細(xì)胞中。
③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉管未愈合時(shí)，剪去柱頭，滴加含有目的基因的DNA。
（2）受體細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞
顯微注射法：將含有目的基因的表達(dá)載體提純→從雌性動(dòng)物體內(nèi)取出卵（體內(nèi)或體外受精）→顯微注射→將注射了目的基因的受精卵經(jīng)早期胚胎培養(yǎng)一段時(shí)間后，移植到雌性動(dòng)物體內(nèi)。
（3）受體細(xì)胞為微生物細(xì)胞
①原核生物作為受體細(xì)胞的優(yōu)越性：繁殖快、多為單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少。
②氯化鈣法(感受態(tài)細(xì)胞法)：Ca+處理細(xì)胞→感受態(tài)（易于吸收周?chē)腄NA分子）細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子。
（四）目的基因的檢測(cè)與鑒定
1、分子水平檢測(cè)
（1）轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因
——DNA分子雜交技術(shù)
（在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做標(biāo)記，作為探針。）
（2）目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA
——分子雜交技術(shù)
（3）目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)
——抗原-抗體雜交技術(shù)（原理：抗原抗體的特異性結(jié)合）
2、個(gè)體水平檢測(cè)
——例如：抗蟲(chóng)接種實(shí)驗(yàn)
三、基因工程的應(yīng)用
（一）植物基因工程
1、抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物：從某些生物中分離出具有殺蟲(chóng)活性的基因，將其導(dǎo)入作物中，使其具有抗蟲(chóng)性。用于殺蟲(chóng)的基因主要是Bt毒蛋白基因（例如我國(guó)的抗蟲(chóng)棉）、蛋白酶抑制劑基因、淀粉酶抑制劑基因、植物凝集素基因等。
2、抗病轉(zhuǎn)基因植物：抗病轉(zhuǎn)基因植物所采集用的基因，使用最多是病毒外殼蛋白基因和病毒復(fù)制酶基因；抗真菌轉(zhuǎn)基因植物中可使用的基因有幾丁質(zhì)酶基因和抗毒素合成基因。
3、抗逆轉(zhuǎn)基因植物：例如：抗寒、抗旱、抗除草劑等。
4、利用轉(zhuǎn)基因改良植物品質(zhì)：（1）高賴(lài)氨酸含量的玉米。（2）耐儲(chǔ)存的番茄。
（二）動(dòng)物基因工程
1、提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度。
2、改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)。
3、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物做器官移植的供體
4、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物獲取藥物：乳腺生物反應(yīng)器
（三）基因工程藥物：例如干擾素
（四）基因治療：把正常基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因的表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮功能，從而達(dá)到治療疾病的目的。
四、蛋白質(zhì)工程的崛起
（一）蛋白質(zhì)工程的概念：
蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有的蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類(lèi)的生產(chǎn)和生活的需求。
【注】基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)工程理論上可以產(chǎn)生自然界不存在的蛋白質(zhì)。
（二）蛋白質(zhì)工程的原理及流程：
1、前提：了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。
2、基本途徑：根據(jù)預(yù)期蛋白質(zhì)的功能，設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列，找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列。（A為轉(zhuǎn)錄，B為翻譯）
3、蛋白質(zhì)工程的主要問(wèn)題：蛋白質(zhì)發(fā)揮功能必修依賴(lài)于正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，而這種高級(jí)結(jié)構(gòu)十復(fù)雜，現(xiàn)階段人們對(duì)其認(rèn)識(shí)不足。
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