文獻(xiàn)中我們經(jīng)常能看見這種圖，也就是流式結(jié)果分析圖，美觀、簡(jiǎn)單、一目了然。

流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）是20世紀(jì)60年代后期開始發(fā)展起來的利用流式細(xì)胞儀快速定量分析細(xì)胞群的物理化學(xué)特征以及根據(jù)這些物理化學(xué)特征精確分選細(xì)胞的新技術(shù)，主要分為流式分析和分選2部分。

今天我們主要介紹流式分析中基本操作與技巧，首先簡(jiǎn)要了解一下什么是流式細(xì)胞術(shù)。

一、流式細(xì)胞術(shù)的3大要素

1. 流式細(xì)胞儀：現(xiàn)在市面上有多種型號(hào)的流式細(xì)胞儀，但其基本結(jié)構(gòu)都是相同的，分析性流式細(xì)胞儀有液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)。

（1）液流系統(tǒng)

（2）光路系統(tǒng)

光路系統(tǒng)始于激光器，其分類分法很多，最常用的分類方法是根據(jù)其發(fā)射的激光的波長(zhǎng)來分，如常見的有488nm的藍(lán)激光器、635nm的紅激光器和405nm的紫激光器，不同的激光器發(fā)出的激光照射到細(xì)胞后產(chǎn)生的光信號(hào)會(huì)經(jīng)過不同的光路系統(tǒng)被不同的通道接收。

流式細(xì)胞儀采集的光信號(hào)包括散射光信號(hào)和熒光信號(hào)，散射光信號(hào)也就是我們常說的FSC（前向散射光，反應(yīng)細(xì)胞的大?。SC（側(cè)向散射光，反應(yīng)細(xì)胞的復(fù)雜程度）；熒光信號(hào)是細(xì)胞上結(jié)合有熒光素，被激光激發(fā)以后，會(huì)發(fā)射熒光信號(hào)。

（3）檢測(cè)分析系統(tǒng)：

流式細(xì)胞儀的檢測(cè)分析系統(tǒng)就是以通道為單位將細(xì)胞的各個(gè)通道的光信號(hào)匯總分析，最后得出樣品群體中細(xì)胞的物理化學(xué)特征。

通道，我們可以理解為就是光電倍增管，有2個(gè)作用，①將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娮有盘?hào)；②放大電子信號(hào)。可以分為散射光通道（FSC通道、SSC通道）和熒光通道，一個(gè)激光器下可以有多個(gè)熒光通道，一個(gè)通道對(duì)應(yīng)多個(gè)熒光染料，例如以beckman的DXflex機(jī)器的638nm紅激光器為例，APC通道可以接收 APC、Alexa Fluor647、eFluor660熒光信號(hào)，原則上，這3種熒光素不能同時(shí)標(biāo)記一個(gè)樣品，否則，就無法分析該通道上的信號(hào)是來自于哪種熒光素。

另一個(gè)重要組成部分就是計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)，例如BD的DIVA系統(tǒng)。

二、樣品細(xì)胞：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的對(duì)象一般是細(xì)胞，并且是呈獨(dú)立狀態(tài)的懸浮于液體中的細(xì)胞，如果要檢測(cè)組織中的細(xì)胞，必須先將組織制備成單細(xì)胞懸液。

三、熒光偶聯(lián)抗體：樣品細(xì)胞只有標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體進(jìn)而被激光照射后才能發(fā)射熒光信號(hào)，從而得到樣品細(xì)胞表達(dá)某抗原分子強(qiáng)弱等情況。

二、流式細(xì)胞術(shù)的基本操作與技巧

以體外培養(yǎng)的PBMC細(xì)胞為例：

1、細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中，直接收集細(xì)胞于1.5ml的EP管中，350g，4°C離心5min，棄上清；

2、然后用1ml FACS buffer重懸沉淀，350g，4°C離心5min，棄上清；

3、封閉：標(biāo)記樣品細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體多為單克隆抗體，少數(shù)也可能是多克隆抗體，其基本結(jié)構(gòu)都由兩部分組成，即包含有特異性結(jié)合抗原位點(diǎn)的Fab段和相對(duì)保守的Fc段，抗體的特異性表現(xiàn)在Fab段，標(biāo)記時(shí)利用Fab段的抗原結(jié)合位點(diǎn)與細(xì)胞上抗原分子特異性結(jié)合，從而標(biāo)記并且相對(duì)量化細(xì)胞表達(dá)該抗原分子的情況。但是，有些細(xì)胞表面表達(dá)FcR(Fc receptor, Fc受體），如巨噬細(xì)胞、DC、B淋巴細(xì)胞等， FcR可以與熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段進(jìn)行非特異性的結(jié)合，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生一定的影響。

封閉方法1： 取適量的血清全I(xiàn)gG抗體與樣品細(xì)胞充分混勻，4'C靜置 15min。研究人的細(xì)胞時(shí)，若熒光素偶聯(lián)抗體來源于小鼠，封閉采用小鼠血清全I(xiàn)gG抗體。 原則是，如果流式抗體可能與樣品細(xì)胞的FcR發(fā)生非特異性結(jié)合，那么在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前先用流式抗體同源的全I(xiàn)gG抗體進(jìn)行封閉，使樣品細(xì)胞表面的FcR飽和。

封閉方法2： 適量的抗CD16和抗CD32單克隆抗體與樣品細(xì)胞充分混勻，4'C靜置 15min。CD16是一種FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力較強(qiáng)； CD32也是一種 FcR, 能夠與IgG的Fc段結(jié)合，親和力中等。 而熒光素偶聯(lián)抗體基本上是IgG抗體，所以在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前可以用抗CD16和抗CD32單克隆抗體封閉樣品細(xì)胞，使樣品細(xì)胞表面的FcR都被抗CD16 或抗CD32單克隆抗體結(jié)合，從而阻止后續(xù)熒光素偶聯(lián)抗體與FcR的非特異性結(jié)合。

4、標(biāo)記相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)抗體，這里以CD3-APC-Cy7、CD4-FITC為例，一般染色體系推薦100μl，CD3、CD4表達(dá)量相對(duì)較高，1μl足夠了，假如有9個(gè)樣本，分別取10μlCD3-APC-cy7、CD4-FITC加到含有990μl的1.5ml的EP管中，混勻后，分別取100μl加到9個(gè)樣品孔中，混勻，室溫、避光染色20min；

5、加1ml FACS buffer洗去未結(jié)合的抗體，350g，4°C離心5min，棄上清，用200μl FACS buffer或2%的多聚甲醛重懸沉淀，盡快上機(jī)分析。

6、電壓的設(shè)定：上機(jī)分析時(shí)，確認(rèn)機(jī)器沒有問題后，首先就是調(diào)節(jié)每個(gè)通道的光電倍增管的電壓，目的是為了區(qū)分細(xì)胞群，假如我們想研究人的淋巴細(xì)胞群，我們都知道人的PBMC含有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞還有中性粒細(xì)胞等，那我們?cè)趺窗阉鼈兎珠_呢？這時(shí)候就要用到我們前面提過的FSC和SSC，通過調(diào)節(jié)FSC和SSC的電壓，區(qū)分淋巴細(xì)胞亞群，原則就是使樣品細(xì)胞或者目標(biāo)細(xì)胞位于流式圖的中央或者靠近中央的位置。FSC和SSC的電壓確定之后就開始調(diào)節(jié)APC-cy7、FITC的電壓（我們可以在鋪細(xì)胞的時(shí)候多鋪一個(gè)孔，染色時(shí)將CD3-APC-cy7、CD4-FITC均染上，用于FSC、SSC、APC-cy7、FITC電壓的調(diào)節(jié)），原則就是使陽性細(xì)胞群和陰性細(xì)胞群盡可能的分離。

7、對(duì)照的設(shè)置：

流式實(shí)驗(yàn)中對(duì)照設(shè)置很重要，常見的有陰性對(duì)照、FMO對(duì)照、補(bǔ)償單陽管對(duì)照。

（1）陰性對(duì)照：每一種細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光，流式檢測(cè)時(shí)得到的熒光信號(hào)是細(xì)胞本身的非特異性熒光和來自于細(xì)胞表面結(jié)合的熒光素的特異性熒光疊加得到的結(jié)果。所以，確定與熒光素?zé)o關(guān)的細(xì)胞自身的非特異性熒光的強(qiáng)弱非常重要，此時(shí)就需要設(shè)立陰性對(duì)照。下圖3類陰性對(duì)照是比較全面的陰性對(duì)照，但我們實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰性對(duì)照不需要3種陰性對(duì)照全部設(shè)置齊全，一般只需要設(shè)置1種陰性對(duì)照就可以了，推薦第1類或第3類。

①  第1類'negative'表示 的是不加任何熒光素偶聯(lián)抗體時(shí)得到的熒光信號(hào)，即“blank”因?yàn)闆]有標(biāo)記任何熒光素，所以這組得到的熒光信號(hào)與熒光素?zé)o關(guān)，與細(xì)胞抗原分子是否表達(dá)無關(guān)，得到的熒光信號(hào)代表的是非特異性熒光信號(hào)（當(dāng)實(shí)驗(yàn)要求不高、已進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)或者能夠確定同型對(duì)照的熒光信號(hào)與不加同型對(duì)照的這種陰性對(duì)照結(jié)果一致時(shí)，就可以采用這種陰性對(duì)照的設(shè)置）；

②  第2類“抗CD69'表示的是用抗CD69抗體標(biāo)記樣品細(xì)胞后得到的熒光信號(hào)，雖然抗CD69抗體能夠與細(xì)胞表面的CD69抗原分子結(jié)合，但是抗CD69抗體沒有偶聯(lián)熒光素，所以得到的熒光信號(hào)也與細(xì)胞表面是否表達(dá)有CD69分子無關(guān)，得到的熒光信號(hào)代表的也只是細(xì)胞本身的非特異性熒光，所以這種對(duì)照用于排除抗體的影響（第2種陰性對(duì)照設(shè)置方法只是一種理論上的設(shè)置方法，是為了便于理解陰性對(duì)照的設(shè)置原理，一般流式分析時(shí)不會(huì)應(yīng)用到這種陰性對(duì)照）；

③  第3類'IgG1-PE'表示的是標(biāo)記與抗CD69抗體同種屬（來源于同一物種）且同類（抗CD69-PE中的抗體是IgGl類的）的非特異性抗體(IgGl)與PE熒光素偶聯(lián)的同型(isotype)對(duì)照抗體(IgGl-PE)后，得到的熒光信號(hào)，這種同型對(duì)照抗體不能與細(xì)胞表面的CD69 發(fā)生特異性結(jié)合，所以細(xì)胞表面不會(huì)結(jié)合有IgGl-PE, 最后得到的熒光信號(hào)不是PE熒光素產(chǎn)生的特異性熒光信號(hào)，而是代表細(xì)胞本身的非特異性熒光，所以這種對(duì)照用于排除熒光素的影響（第3種陰性對(duì)照的設(shè)置方法，稱為同型對(duì)照設(shè)置，是常規(guī)的陰性對(duì)照設(shè)置法，正式的流式圖的數(shù)據(jù)都必須建立在這種同型對(duì)照的基礎(chǔ)之上，在同型對(duì)照基礎(chǔ)上得出的流式結(jié)果是最可靠的，尤其是對(duì)于一些陰陽分群不明顯的情況下，可將同型對(duì)照作為劃門的依據(jù)）。

（2）FMO（fuorescence-minus-one control）對(duì)照：即減去一個(gè)熒光抗體（一般是表達(dá)量低、背景熒光干擾強(qiáng)），其它組合不變，是一種特殊的陰性對(duì)照，多在研究不同細(xì)胞亞群表達(dá)某些重要的表型分子、細(xì)胞因子等時(shí)應(yīng)用。如Foxp3 FMO，也就是不加Foxp3-PE，只加入CD4、CD25，與三個(gè)染料都加組相比，多出來的那部分就是Treg細(xì)胞群。

（3）補(bǔ)償單陽管對(duì)照:以上面我們提到的CD3-APC、CD4-FITC為例，在這里，我們要設(shè)置PE單染管和FITC單染管，用于補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)，一般單染管要求有明顯的陽性細(xì)胞群，像CD3、CD4表達(dá)量都很高，陽性細(xì)胞群明顯，但對(duì)一些抗原表達(dá)弱的情況（陽性細(xì)胞群基本看不到），例如CD25，這時(shí)候有必要借助補(bǔ)償微球。

總結(jié)

常見對(duì)照的作用

三、注意事項(xiàng)

（1）在細(xì)胞制備、培養(yǎng)階段，如果該培養(yǎng)細(xì)胞是貼壁細(xì)胞，需用先用胰酶消化細(xì)胞，然后收集待測(cè)樣品細(xì)胞，離心、洗滌、封閉后標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體即可。

（2）如果是胸腺、脾臟和淋巴結(jié)等外周免疫器官，主要由免疫細(xì)胞組成，制成單細(xì)胞懸液，只需直接將臟器經(jīng)鋼網(wǎng)研磨即可。

（3）如果是實(shí)體臟器肺臟、肝臟和腫瘤組織內(nèi)含有較多的結(jié)締組織，實(shí)體臟器細(xì)胞之間一般結(jié)合緊密，所以直接研磨臟器法無法得到理想的單細(xì)胞懸液。因此，研磨前需將臟器剪碎后加入IV型膠原酶和DNA核酸內(nèi)切酶消化，消化后的組織再用研磨棒直接研磨。實(shí)體臟器研磨后的單細(xì)胞懸液以實(shí)體細(xì)胞為主，如果研究目標(biāo)不是實(shí)體細(xì)胞，而是臟器內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，可以用Percoll密度梯度離心法富集免疫細(xì)胞，然后再進(jìn)行流式分析。

（4）調(diào)節(jié)電壓時(shí)，如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較小，可以適當(dāng)提高電壓值，使目標(biāo)細(xì)胞與細(xì)胞碎片在流式圖中能夠完全分離；如果檢測(cè)的目標(biāo)細(xì)胞體積較大，可以適當(dāng)降低電壓值，使所有的目標(biāo)細(xì)胞群完整顯示于流式圖中，防止細(xì)胞群接近于流式圖的邊界而變形扭曲或者完全處于邊界外。

（5）關(guān)于樣本的封閉，并不是標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體之前必須封閉樣品，一般樣品細(xì)胞與流式抗體的種屬來源是不同的，如標(biāo)記人的細(xì)胞的熒光素偶聯(lián)抗體一般來源于小鼠，人細(xì)胞的FcR也不一定能夠與小鼠來源的熒光素偶聯(lián)抗體的Fc段結(jié)合，但是，也有可能因?yàn)榉N屬關(guān)系較近，或者在一定環(huán)境條件下這種不同種屬間的Fc段和FcR也能結(jié)合，實(shí)驗(yàn)者很難判斷實(shí)驗(yàn)過程中這種結(jié)合是否會(huì)發(fā)生，但是在標(biāo)記熒光素偶聯(lián)抗體前封閉樣品卻可以保證這種非特異性結(jié)合一定不會(huì)發(fā)生。所以，條件允許的話，實(shí)驗(yàn)者最好養(yǎng)成封閉樣品的習(xí)慣。