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作者 | 姬瑞

單位 | 榆林市第五醫(yī)院

隨著新冠疫情趨于常態(tài)化，核酸檢測已成為人們生活中的一部分。為了監(jiān)測“采樣“、“提取、擴增”等環(huán)節(jié)，目前市場上多個產(chǎn)品均在核酸擴增試劑內(nèi)加入了“內(nèi)標”，包括“內(nèi)源性內(nèi)標”和“外源性內(nèi)標”，兩種方式各有利弊。

· 內(nèi)源性內(nèi)標可以在“單檢”場景下檢測到是否采集到了足夠的人體細胞;

· 外源性內(nèi)標在檢測中能夠更好反映“提取”和“擴增”的效率，另外在“環(huán)境樣本”檢測中，能夠更好的發(fā)現(xiàn)樣本提取或者擴增效率不足的情況，從而提示檢驗人員警惕假陰性結(jié)果。

PCR擴增靶標基因擴增呈現(xiàn)“陰性”，存在以下可能：①受試者為“真陰性”，②由于采樣、提取和擴增階段存在問題，導致的“假陰性”。

各個廠家為了減少“假陰性”的發(fā)生率，可通過檢測內(nèi)標核酸是否“起線”，判斷是否存在“采樣、提取、擴增”導致的假陰性。

內(nèi)標分為“內(nèi)源性內(nèi)標”和“外源性內(nèi)標”。內(nèi)源性內(nèi)標采用的是人的管家基因，存在于人的基因組中，可以監(jiān)測核酸檢測的全流程，包括取樣、樣本提取、PCR擴增過程。外源性內(nèi)標采用的為非人源基因作為內(nèi)標，是假病毒或質(zhì)粒，在提取之前加入，監(jiān)測核酸檢測的樣本提取、PCR擴增過程，不能監(jiān)測取樣過程^[1]。兩者的分析比較如下:

表 內(nèi)源性內(nèi)標與外源性內(nèi)標的區(qū)別

試驗一：

在真實的新冠核酸篩查中，96孔的樣本提取檢測，可由于多種原因，出現(xiàn)單孔提取、擴增效率降低，甚至出現(xiàn)假陰性的情況。

本試驗在單孔（B6孔）中降低磁珠用量，以模擬提取效率不足，進而觀察“內(nèi)源性”和“外源性”內(nèi)標對提取環(huán)節(jié)的監(jiān)測效果。

圖1“內(nèi)源性內(nèi)標”擴增曲線圖，B6孔提取樣本Ct值并無明顯異常

圖2“外源性內(nèi)標”擴增曲線圖，B6孔提取樣本Ct值明顯高于其他樣本，提示該樣本可能存在提取或擴增效率不足的問題

所有使用“內(nèi)源性內(nèi)標”擴增的樣本中，內(nèi)標擴增的Ct值在18.8~31.2之間，B6孔提取樣本Ct值為25.3，難以發(fā)現(xiàn)B6孔樣本提取存在問題。這是因為“內(nèi)源性內(nèi)標”采用的是檢測人體的“管家基因”，“管家基因”的核酸分子數(shù)量取決于采樣情況，“內(nèi)源性內(nèi)標”的Ct值高，可能原因包括：采樣不足，核酸提取、擴增效率較低^[1]。

另一方面，使用“外源性內(nèi)標”擴增樣本中，除外B6孔樣本，其他樣本擴增的Ct值均較為集中，在30.9~31.8之間，重復(fù)性好。B6孔的提取樣本Ct值為33.7，明顯高于其他樣本，提示B6孔的樣本提取或擴增效率較低。

這是因為，“外源性內(nèi)標”提前在反應(yīng)體系中加入的定量“假病毒或質(zhì)粒”，核酸分子量是較為穩(wěn)定的。因此，當“外源性內(nèi)標”Ct值較高時，因考慮核酸提取或者擴增效率不足，如果該樣本靶標基因檢測結(jié)果為陰性，應(yīng)警惕“假陰性”可能。

試驗二：

《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第八版）》中提出，要采用“多渠道監(jiān)測預(yù)警”，包括生物樣本和環(huán)境樣本的檢測。提示，環(huán)境樣本檢測在疫情防控中也發(fā)揮著重要作用。但環(huán)境樣本成本較為復(fù)雜，含有多種物質(zhì)可抑制PCR擴增反應(yīng)，導致結(jié)果假陰性。最常見的強抑制性物質(zhì)是“腐植酸“，多見于泥土樣本^[2]。

該實驗是采用泥土（含腐植酸）、灰塵樣本；分別模擬含有強抑制物和不含抑制物的樣本，分別采用“內(nèi)源性”和“外源性內(nèi)標”擴增試劑檢測，評估兩種內(nèi)標的對樣本中是否存在抑制物的監(jiān)測能力。

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