一、知識背景：
1. 基因表達(dá)：DNA——RNA——Protein
單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機制，如一個蠶絲心蛋白基因——104個絲心蛋白mRNA（每個mRNA存活4d，可以合成105個絲心蛋白）——共合成109個絲心蛋白 。因此單拷貝基因的mRNA表達(dá)水平對于其功能水平的調(diào)控是非常重要的。
2. PCR技術(shù)(Polymerase chain reaction)：
即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
在模板、引物和四種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，其特異性由兩個人工合成的引物序列決定。反應(yīng)分三步：
A.變性：通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；
B.退火：將反應(yīng)混合液冷卻至某一溫度，使引物與模板結(jié)合。
C.延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘ —— 3’方向延伸。
以上三步為一個循環(huán)，如此反復(fù)。
3. 逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-PCR
逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒體內(nèi)的依賴RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三種活性：
(1)依賴RNA的DNA聚合酶活性：以RNA為模板合成cDNA第一條鏈；
(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA雜合體中的RNA；
(3)依賴DNA的DNA聚合酶活性：以第一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈cDNA.
二、RT-PCR的準(zhǔn)備：
1. 引物的設(shè)計及其原則：
(1)引物的特異性決定PCR反應(yīng)特異性。因此引物設(shè)計是否合理對于整個實驗有著至關(guān)重要的影響。在引物設(shè)計時要充分考慮到可能存在的同源序列，同種蛋白的不同亞型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA對引物的特異性的影響。盡量選擇覆蓋相連兩個內(nèi)含子的引物，或者在目的蛋白表達(dá)過程中特異存在而在其他亞型中不存在的內(nèi)含子。
(2)引物設(shè)計原則的把握：引物設(shè)計原則包括:
a.引物長度:一般為15～30 bp ，引物太短會影響PCR的特異性，引物太長PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最適溫度，也影響反應(yīng)的特異性。
b.堿基分布：四種堿基最好應(yīng)隨機分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特別是連續(xù)出現(xiàn)3個以上的單一堿基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR擴增的復(fù)性溫度一般是較低Tm值減去5～10度。
c.3‘端要求：3’端必須與模板嚴(yán)格互補，不能進(jìn)行任何修飾，也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)的可能。末位堿基是A時錯配的引發(fā)效率最低，G、C居中間，因此引物的3’端最好選用A、G、C而盡可能避免連續(xù)出現(xiàn)兩個以上的T。
d.引物自身二級結(jié)構(gòu)：引物自身不應(yīng)存在互補序列，否則會自身折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)或引物自身復(fù)性。
e.引物之間的二級結(jié)構(gòu)：兩引物之間不應(yīng)有多于4個連續(xù)堿基互補，3’端不應(yīng)超過2個。
f.同源序列：引物與非特異擴增序列的同源性應(yīng)小于連續(xù)8個的互補堿基存在。
g.5’端無嚴(yán)格限制：5’末端堿基可以游離，但最好是G或C，使PCR產(chǎn)物的末端結(jié)合穩(wěn)定。還可以進(jìn)行特異修飾（標(biāo)記、酶切位點等）等等。
根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)囊?。常用引物設(shè)計軟件如Primer5.0，Oligo6.0等對于這些條件都可以自行設(shè)置。
2. 耗材：
實驗所用的接觸樣品的耗材如凍存管、槍頭、EP管之類事先都需經(jīng)過0.1%DEPC水浸泡處理，除去RNA酶，防止操作過程中RNA降解。然后經(jīng)高壓滅活（滅菌和滅活DEPC）。
3. 試劑準(zhǔn)備：
變性液、水飽和酚、乙酸鈉、氯仿、異丙醇、75%酒精、經(jīng)DEPC處理并高壓的水。
三、RNA的提取方法：
RT－PCR中從細(xì)胞分離的RNA的質(zhì)量至關(guān)重要，包括RNA的純度和完整性。RNA分離的最關(guān)鍵因素是盡量減少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常穩(wěn)定，分布廣泛，除細(xì)胞內(nèi)源性RNA酶外，環(huán)境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA時，應(yīng)盡量創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制內(nèi)源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質(zhì)變性劑如異硫氰酸胍抑制內(nèi)源性RNA酶。
RT－PCR步驟：
1、RNA的提?。?/strong>
2、cDNA的合成：
逆轉(zhuǎn)錄體系的組成：
3、PCR擴增：
50ul PCR體系的組成：
4、PCR反應(yīng)條件：
四、PCR條件的優(yōu)化：
PCR條件的優(yōu)化主要是
①引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計軟件推薦溫度的上下2 ℃變化尋找最佳退火溫度。
②此外Mg2＋濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳濃度為2 mM左右。
③引物和模板的量等。
五、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定：
根據(jù)產(chǎn)物長度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠（不同長度產(chǎn)物所需凝膠濃度），取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統(tǒng)成像分析。
分離不同大小DNA片段的合適瓊脂糖濃度
六、需注意的問題：
1. 注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：氯仿、溴化乙錠（EB）、酚、異硫氰酸胍、紫外線等。
2. 注意避免試劑污染。
3. 始終注意避免RNA酶的污染。
4. 保管好自己專用的試劑，公用試劑保管好，相互協(xié)調(diào)，注意實驗室衛(wèi)生。
