作者：解螺旋.老談
如需轉載請注明來源：解螺旋·醫(yī)生科研助手
當很多小伙伴還徘徊在miRNA時，lncRNA已經橫空出世，還沒得來得及反應過來lncRNA到底是怎么回事時，circRNA又開始嶄露頭角了?？蒲芯褪沁@樣，你落后一步，便步步落后，跟娶媳婦生孩子是一樣一樣的。說回正題，應部分解螺旋粉絲的要求，今天老談幫大家整體梳理了曾經紅極一時、目前熱度不減的IncRNA的研究思路和模式以及相關工具，希望能對那些想在IncRNA研究上有所作為的小伙伴能助上一臂之力。
IncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程。很多人看到lncRNA的熱度還沒有過去，經常會問老談如果沒有相關的工作基礎，如何開始lncRNA的研究?今天我們就褪去虛偽外衣，研究的大方向是這樣子的：
1. 尋找到lncRNA分子
2. lncRNA分子表型研究
3. lncRNA通過何種機制調節(jié)表型？
老談將這些研究方向及實驗手段按層次的方式繪成流程圖，如下所示：
首先，是樣本的準備與收集。高質量的樣本是實驗結果具有可靠性的前提。
其次，是lncRNA檢測?？梢韵韧ㄟ^芯片的方式高通量篩選到目的基因，然后通過q-PCR或Northern blot的方法驗證所得到的芯片結果。
再次，其研究方向根據研究目的而定。如果是研究生物標志物，那么可以通過收集更多的臨床樣本，研究lncRNA對疾病的指示作用。如果是研究其功能，則是研究其細胞表型、分子表型及機制。
小伙伴們是不是覺得這和miRNA的總體研究思路相似呢？這時可以根據各自的實驗平臺條件選擇相應的研究。值得注意的是，lncRNA的功能研究并不像miRNA一樣通過3’UTR影響翻譯套路，總的來說lncRNA機制研究套路還不成熟。對于很多科研工作者而言，lncRNA分子的獲得及其細胞表型的獲得并非難事，關鍵在于如何進行下一步研究，這時候就要涉及到對功能研究的定位。歸納如下：
lncRNA的功能分為3方面:
1. 通過修飾染色體參與表觀調節(jié)；
2. 通過與轉錄因子的相互作用參與轉錄調節(jié)；
3. 通過影響mRNA處理過程參與轉錄后調節(jié)。
在以上3個方向的研究中，其中轉錄后調節(jié)相對簡單，大家在選擇lncRNA的時候，可以對其序列做一下分析，看看自己研究的lncRNA是作為miRNA的sources還是sinks？
另外兩方面的調節(jié)機制均涉及RNA-蛋白質的相互作用。在沒有目的蛋白的時候，此時不得不使用先進技術，用于檢測RNA-蛋白質相互作用的實驗手段如下：
RNA-蛋白質相互作用的檢測手段有nRIP、CLIP；lncRNA由于其長片段核苷酸序列，則堿基之間相互作用，通常具有二級結構，可通過RNase足跡等實驗手段進行探討；在染色體結構修飾作用中，還會涉及RNA-RNA的相互作用，可通過CHIRP等實驗手段來研究。
由于上述實驗手段比較難得，lncRNA的機制研究相對還是比較困難。那我們該怎樣進行l(wèi)ncRNA研究呢？咱換個思路，不要將lncRNA作為一個調節(jié)分子，而是把lncRNA當做和mRNA一樣的分子來研究，盡管很少表達蛋白。在體外，可以通過分子干擾手段，進行分子及表型研究；在體內，也是如此。兩者通過各種組合，那就等著發(fā)5分的文章吧。
我們先來談一談“老瓶”——基因研究模式。
首先向大家灌輸“文章模塊化拆解的核心思想”。打個比喻，不管是億萬富翁還是街頭的流浪漢，作為人這個物種，他都有手腳心肝肺等，即使他們的外在地位不一樣，但作為物種來講，他們組成形式都差不多?；A科研的文章也一樣，十篇文章可能有十個分值，但是他們的組成模塊其實差不多，都是由“領域”、“分子”、“效應”、“通路”組成（如下圖所示），不同的文章就是不通模塊的組合。
上面這個研究模式大家是不是很親切？
其實，lncRNA研究也可以裝進上面那個老瓶里，只不過把“gene”換成“l(fā)ncRNA”而已。下面是一個lncRNA普通模板實例：領域（膽囊癌）、分子（lncRNA）、效應{方法驗證（敲減效率）、細胞層次（MTT實驗、轉移小室、克隆形成實驗）和動物層次}。
這篇文章并不涉及機制研究，所以各位小伙伴是不是覺得分外眼熟？除去機制研究，和普通基因的研究模式是不是很接近呢！
基本套餐的lncRNA和基因研究不同點在于機制研究，兩者的研究手段不一樣。lncRNA機制研究的常用技術為：RACE技術、RNA pulldown技術、RIP（RNA immunoprecipitation）技術。幸運的是，目前l(fā)ncRNA不需要做到機制層面也能發(fā)表一篇2-3分檔次的SCI，有興趣的小伙伴還不趕緊小試身手！
經典的教科書上所記錄的中心法則: DNA→RNA→蛋白。但是隨著分子生物學的不斷發(fā)展，非編碼RNA已經越來越顯示出重要的功能。經過將近十年的深入研究，研究者已經發(fā)現了多種lncRNA的作用模式。但是面對紛繁復雜的lncRNA作用模式，小伙伴們是不是感到無從下手？今天老談就把lncRNA的作用模式總結一下，希望幫助小伙伴們更好地理解。
lncRNA 的作用模式可以分為四大類: signal，decoy，guide，scaffold。
１、signal：
lncRNA的第一種作用是調控下游基因轉錄。已有研究發(fā)現，不同的刺激條件和信號通路下，lncRNA將會被特異性地轉錄，并作為信號傳導分子參與特殊信號通路的傳導。一些lncRNA分子被轉錄后，擁有調控下游基因轉錄的作用。從生物體的角度而言，利用RNA進行轉錄調控是具有明顯優(yōu)勢的，因為利用RNA進行調控，且不涉及蛋白質的翻譯，因此具有更好的反應速度，對于機體的某些急性反應可以做出更好更迅速的反應。
2、decoy：
lncRNA的第二種作用是分子阻斷劑。這一類lncRNA被轉錄后，會直接和蛋白（一般都是轉移因子/轉錄調節(jié)子）結合，從而阻斷了該分子的作用和信號通路。由于lncRNA的結合，這類轉錄因子的功能被阻斷，從而調控下游的基因轉錄。
3、guide：
第三種作用模式是lncRNA與蛋白結合（通常是轉錄因子），然后將蛋白復合物定位到特定的DNA序列上。研究發(fā)現lncRNA介導的這種轉錄調控作用可以是順式作用模式，也可以是反式作用機制，因此僅僅從lncRNA的序列上是無法獲得信息的。
4、scaffold：
lncRNA 還可以起到一個“中心平臺”的作用，即多個相關的轉錄因子都可以結合在這個lncRNA分子上。在細胞機體中，當多條信號通路同時被激活，這些下游的效應分子可以結合到同一條lncRNA分子上，實現不同信號通路之間的信息交匯和整合，有利于機體/細胞迅速地對外界信號和刺激產生反饋和調節(jié)。
需要注意的是，雖然lncRNA的作用模式可以總結為上述四種，但是這四種作用機制和模式是相互關聯，而非相互排斥的。千萬不要孤立且割裂地看待lncRNA的作用方式，這樣會使視野受限，不利于更好地理解lncRNA的機制。
有關所有l(wèi)ncRNA全方面的功能研究還需要進一步的探索，少不了需要裝配研究的利器，幫助我們在尋求相關lncRNA信息時能夠手到擒來，不費吹灰之力！今天老談就跟大家分享一些研究lncRNA的數據庫，幫助大家做好科研準備工作。
1.NONCODE：
NONCODE提供對長鏈非編碼RNA的全面注釋，包括表達和ncFANs計算機軟件預測的lncRNA功能。這是非編碼RNA研究的知名數據庫，已經更新到2014年的8月了。
網址：http://www.noncode.org
Note：小伙伴們要小心使用時，可能出現的各種狀況，因為這個網站對lncRNA的命名方法是他們網站內部命名的系統(tǒng)??！要哭了有沒有，根本找不到你要的lncRNA……但有個辦法解決，因為他們的網站有Blast系統(tǒng)，你如果有l(wèi)ncRNA序列的話，還是能找到對應的編號的。對于lncRNA在不同組織中的表達的研究還是挺有用的。
2.lncRNAdb:
提供有生物學功能的長鏈非編碼RNA的全面注釋。這是長鏈非編碼RNA研究領域的大牛Johnmattick實驗室構建的網站。
網址：http://www.lncrnadb.org/
Note：這個用下來憑良心說還行，輸入lncRNA名稱之后，會對這個lncRNA的功能及表達進行注釋。這個網站用的是NCBI上Gene的命名法，使用上還是沒有障礙的。
3.CHIPbase：
提供長鏈非編碼RNA的表達圖譜和轉錄調控的全面鑒定和注釋，整合了高通量的RNA-seq鑒定的lncRNA及其表達圖譜和ChIP-Seq實驗技術鑒定的轉錄因子結合位點。
網址：http://deepbase.sysu.edu.cn/chipbase/
Note：中大的這個數據庫主要是對于一些lncRNA的表達及l(fā)ncRNA與轉錄因子之間的關系的一個注釋數據庫。主要可以了解與轉錄因子相關的lncRNA的結合情況。要調取lncRNA的表達數據，勸你選別的數據庫，因為這個網站極其坑爹，只能輸入GeneSymbol，并不是基因名，其實是lncRNA的轉錄名，一般是什么“RP11-XXXX”。舉個例子：lncRNA2-1的基因名其實是“LncRNA2.7”，轉錄名是“RP11-34P13.8”，這需要注意哦。
4.LncRNome：
超過18000轉錄本目前已作為lncRNA標注，覆蓋先前注釋非編碼轉錄本，包括大型基因間非編碼RNA、反義RNA和加工的假基因。但在提供穩(wěn)定的注釋，交叉引用和生物相關的信息資源方面有顯著的差距。由印度CSIR基因組和整合生物學研究所的研究人員開發(fā)的lncRNome，旨在填補這一空白，他們通過把生物顯著性的各種各樣的信息注釋整合到一個全面的知識庫。
網址：http://genome.igib.res.in/lncRNome
Note：三哥三姐確實NB，但記住：查詢的話，還是轉錄名：“RP11-XXXX”那種，也有其他命名法的“HAS-LNCXXXX”這種。功能上挺強大，有l(wèi)ncRNA的二級結構，lncRNA的蛋白互作功能預測，還有l(wèi)ncRNA的SNP位點。總的來說還不錯，就是搜索起來麻煩點。
5.Starbase：
一個高通量實驗數據CLIP-Seq（或稱為HITS-CLIP, PAR-CLIP , iCLIP）和mRNA降解組測序數據支持的microRNA靶標數據庫,包含了miRNA-mRNA，miRNA-lncRNA，miRNA-circRNA，miRNA-ceRNA和RNA-protein等的調控關系。整合和構建多個流行的靶標預測軟件的交集和調控關系。
網址：http://starbase.sysu.edu.cn/
Note：中大的良心之作，主要功能就是查詢lncRNA與miRNA的互作，蛋白及l(fā)ncRNA的互作，以及正在火的ceRNA預測。不過主要功能其實還是在miRNA上。
6. LncRNADisease:
提供了文獻報道的疾病相關的長鏈非編碼RNA的注釋。
網址：http://cmbi.bjmu.edu.cn/lncrnadisease
Note：可以在網站中瀏覽。注意，是瀏覽lncRNA與疾病的關系注釋，其實還是蠻有用的?？梢悦馊ノ覀?yōu)閘ncRNA名字糾結的麻煩。
lncRNA的種類遠遠超過編碼RNA，4%~9%的哺乳動物基因組序列產生的轉錄本是lncRNA（相應的編碼蛋白的RNA比例是1%-5%）。另外，還有LNCipedia、NRED、PLncDB等lncRNA數據庫，功能與上述幾個略有重復，老談覺得精通幾個功能強大的數據庫足矣！不過分享再多也需要小伙伴們親身使用才能真正帶來益處。
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