1. 樣品元基因組提取
樣品元基因組抽提核心思想：
盡可能多的獲得樣本中各種微生物的基因組DNA。
樣本元基因組提取的重要性：
最大程度獲得樣本中各種微生物的基因組DNA，為后續(xù)樣本的分析和比較提供完整的微生物種類及豐度信息。否則，分析環(huán)節(jié)“形同虛設(shè)”，永遠(yuǎn)分析不出真實(shí)結(jié)果。
對(duì)樣品的一些思考：
a）樣本收集的難易程度；
b）樣本的珍貴程度；
c）怎樣用盡可能少的單個(gè)樣本使用量來(lái)幫助客戶完成研究目的；
d）怎樣在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前就確?？蛻艚Y(jié)果的準(zhǔn)確性；
e）復(fù)雜環(huán)境中的樣本基因組如何能夠更全面的獲取。
元基因組提取的主要原理（核心步驟）：
①通過(guò)高溫化學(xué)裂解法和物理?yè)舸蚍ǔ浞至呀饧?xì)胞；
②離心法除去雜質(zhì)、抑制物等；去除破碎細(xì)胞中的蛋白質(zhì)；
③純化DNA；
④消化RNA。
元基因組提取的主要流程：
1）樣品準(zhǔn)備：
樣本-80℃保存；
避免樣本出現(xiàn)反復(fù)凍融，影響樣本中微生物組成，樣本均在冰盒或干冰上完成拿取和轉(zhuǎn)移。
2）化學(xué)裂解+物理?yè)舸?/strong>
I.化學(xué)裂解：
作用：采用化學(xué)方式破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞核膜充分釋放細(xì)胞內(nèi)容物。
II.物理?yè)舸颍?/p>
作用：針對(duì)細(xì)胞膜難以裂解或裂解不充分的微生物，采用玻璃珠碰撞產(chǎn)生剪切力進(jìn)行物理干預(yù)破壞；
材料：玻璃珠。
3）酚類及生物堿干擾物的去除
PVPP：
作用：
a）去除酚類和生物堿；
b）可參與配制適合的緩沖溶液反復(fù)浸提體系中的DNA，同時(shí)吸附雜質(zhì)。
4）蛋白質(zhì)、雜質(zhì)、抑制劑干擾物的去除
HTR等試劑
純化DNA；
Rnase A 消化RNA；
獲得DNA溶液；
2. PCR文庫(kù)擴(kuò)增
高保真pfu酶的使用：
作用：
①降低擴(kuò)增環(huán)節(jié)堿基錯(cuò)配率；
②校正作用；
③保真性大于Taq酶；
④產(chǎn)生平末端。
最低循環(huán)數(shù)的控制：
a）循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響：
1）降低擴(kuò)增環(huán)節(jié)堿基錯(cuò)配率；
2）校正作用；
3）保真性大于Taq酶；
4）產(chǎn)生平末端。
b）解決方法：
1）根據(jù)樣本來(lái)源及類型，利用預(yù)實(shí)驗(yàn)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)條件進(jìn)行摸索，用最低的循環(huán)數(shù)獲得滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度要求的擴(kuò)增產(chǎn)物。
2）因樣本間存在質(zhì)量差異等情況，應(yīng)保持每個(gè)樣本擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)統(tǒng)一。
c）擴(kuò)增DNA模板濃度的均一性
根據(jù)樣本類型和來(lái)源，將擴(kuò)增時(shí)樣本DNA濃度調(diào)整至一致，以免由于樣本DNA濃度差異造成擴(kuò)增后產(chǎn)生偏差，增加樣本間的可比性。
d）建庫(kù)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)
1）采用擴(kuò)增形式進(jìn)行接頭添加；
2）利用最低循環(huán)數(shù)確保完成建庫(kù)。
3.實(shí)驗(yàn)過(guò)程質(zhì)控
陰、陽(yáng)性對(duì)照設(shè)置
1）元基因組提取環(huán)節(jié)：
①設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控提取效果；
②設(shè)置陰性對(duì)照，監(jiān)控提取流程。
2）PCR環(huán)節(jié)：
①設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，監(jiān)控?cái)U(kuò)增效果；
②設(shè)置陰性對(duì)照，監(jiān)控PCR操作流程；
③擴(kuò)增抽提環(huán)節(jié)陰性對(duì)照，監(jiān)控抽提是否有污染；
④擴(kuò)增抽提環(huán)節(jié)陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證抽提效果。
4.數(shù)據(jù)分析優(yōu)先級(jí)的確定
下機(jī)數(shù)據(jù)分析優(yōu)先級(jí)：
1）分析陽(yáng)性對(duì)照：觀察實(shí)驗(yàn)、測(cè)序環(huán)節(jié)是否有問(wèn)題；
2）比較分析不同測(cè)序run之間的陽(yáng)性對(duì)照，排除測(cè)序批次間的差異性。
3）按照要求分析該批次中的樣本
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